中药黄芪内生菌的分离鉴定及方法分析

胡青,诸葛增玉,任超(天津农学院动物科学与动物医学学院,天津西青300384)

中药黄芪内生菌的分离鉴定及方法分析

胡青,诸葛增玉,任超
(天津农学院动物科学与动物医学学院,天津西青300384)

为探索中药内生菌在动物免疫中作用机理和避免抗生素的耐药性提供新的途径,本研究分析了黄芪内生菌的种类,对其进行分离鉴定和活性筛选.以黄芪健康植株上的块根为材料,经过组织筛选、表面消毒、对照处理、培养基选择、分离菌的培养,形态学和革兰染色鉴定等研究方法,获得真菌17株,分列7个菌属中;细菌34株,革兰阳性菌19株、革兰阴性菌15株,以单胞杆菌和芽孢杆菌属为主.牛肉膏蛋白胨固体培养基上生长情况最好,为28株.LB固体培养基上次之,为20株.高氏I号培养基上得到3株.

黄芪;内生菌;生物多样性;生物活性;分类鉴定

中药内生菌(Plant Endophyte)是存活于健康植物组织或器官内部、不引发宿主植物表现出明显感染症状的一类微生物[1].目前内生菌被认为是筛选新型抗生素的重要资源.

中药内生菌的研究主要采用植物组织培养法分离,再进行种类鉴别.结合本研究的条件和目的,我们选用培养条件的异同、形态学观察、革兰染色的方法.

黄芪可以提高免疫功能,临床上广泛用于治疗神经系统、消化系统、呼吸系统、内分泌和免疫系统等疾病[2].研究黄芪内生菌的生物多样性,为解决野生黄芪生长缓慢,资源紧缺,使用抗生素的耐药性和采挖的过程中破坏生态环境等诸多问题提供了新的方法.

1　材料与方法

1.1植物材料甘肃多枝黄芪的健康植株.

1.2试剂牛肉膏、蛋白胨、NaCl、酵母提取物、胰蛋白胨(北京奥博星生物技术有限责任公司)、硝酸钾、磷酸氢二钾、七水硫酸镁、七水硫酸亚铁、可溶性淀粉(天津市化学试剂一厂)、琼脂(JAPAN Storage RT)、乙醇、次氯酸钠、pH值试纸等.

1.3方法与步骤

1.3.1培养基的制作3种培养基:牛肉膏蛋白胨固体培养基、LB固体培养基、高氏Ⅰ号固体培养基. 1.3.2材料的处理黄芪根块冲洗干净,晾至表面无水珠,取主根切成约3 cm左右的小段.用75%乙醇溶液漂洗3 min,无菌水冲洗3次.再用10%次氯酸钠溶液浸泡7 min,无菌水冲洗3次.

1.3.3组织培养将上述处理过的根段在无菌条件下切去两端,剩余部分分割成小片,随机将小片分别种植于3种培养基平板上,每种培养基设置3个平行皿,每个皿放4片,置于30℃恒温培养箱中培养3～7 d.

1.3.4对照组分别设置接组织块对照、接洗涤水对照、直接印记对照、接未做任何处理的组织块对照、接无菌水对照、空白对照.

1.3.5内生菌的分离纯化观察试验培养皿及对照皿的情况,随时观察出菌情况及组织片变化,待根组织边缘长出菌后,挑取菌丝或菌体,经平板划线法反复分离、纯化,培养观察菌落形态,比较3种培养基对黄芪内生菌的分离情况,并对菌落的生长及特性做相应的记录.

1.3.6镜检鉴定挑取待检菌体制片,于显微镜下镜检.革兰染色,油镜观察.

2　结果与分析

2.1表面消毒效果3种培养基的组织片培养均有内生菌生长.对照组中,除组织块的培养得到内生菌外,其余均未观察到内生菌.

2.2培养结果黄芪内得到内生菌51株.牛肉膏蛋白胨培养基上得到内生菌28株,LB固体培养基上得到内生菌20株,高氏Ⅰ号培养基上得到内生菌3株.

2.3内生菌的鉴定

2.3.1形态学鉴定真菌共分离出17株内生真菌,根据培养条件、菌落形态及形态观察,初步合并为11株形态型,观察并记录菌落形态(表1)和主要显微结构(见中插彩版图1).参照《真菌鉴定手册》[3],显微镜镜检分类确定为在17株黄芪内生菌中,镰孢菌属4株、瓶霉菌属3株、丝核菌属3株、赤壳属2株、枝顶孢属2株、曲霉属2株、青霉属1株.

表1　黄芪内生真菌培养24 h的菌落形态特征

2.3.2革兰染色鉴定细菌根据培养条件、菌落形态、革兰染色及形态观察,初步合并为10株形态型,菌落形态(表2)和主要显微结构(见中插彩版图1)参照《伯杰细菌鉴定手册》[4]对目标菌进行分类:在获得的34株菌中,革兰阳性菌共19株、革兰阴性菌共15株.以芽孢杆菌属、单胞杆菌、短小芽孢杆菌和假单孢菌为主,分别为12株、10株、7株、5株.

表2　黄芪内生细菌的菌落特征和革兰染色

3　讨论

本研究中镰孢菌属为黄芪内生真菌的优势菌属,占23.53%.其次是瓶霉菌属,占17.64%,其发酵浓缩液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和肠炎沙门菌等均有一定抑菌活性.其他还有枝顶孢属11.76%,其菌丝体具有免疫调节的作用[5].真菌也是黄芪的常见内生菌.细菌中革兰阳性菌占多数为55.88%;革兰阴性菌占44.12%.其中芽孢杆菌属35.29%,是黄芪内的优势菌属,有较强的抑菌效果[6].因实验室无法真实还原黄芪生长环境,所以对内生菌种属的精确鉴定,还需要在传统形态学鉴定基础上结合分子生物学方法一起鉴定.

研究黄芪内生菌,在生物防治、医疗卫生等领域有着广阔的应用前景.黄芪内生菌的价值在今后的研究中要深入挖掘,并向多元化发展.

[1]吴元华,田秀玲.植物内生菌研究进展及其存在的问题[J].生态学杂志,2004,23(2):86-91.

[2]贺学礼,卢彦琪.黄芪化学成分及药理作用综述[J].保定师范专科学校学报,2004,17(4):40-42.

[3]魏景超.真菌鉴定手册[M].上海:上海科学技术出版社, 1979:73-135.

[4]布坎南R E B.伯杰细菌鉴定手册[M].中国科学院微生物研究所《伯杰细菌鉴定手册》翻译组,译.北京:科学出版杜, 1984:169-233.

[5]Poulev A,O Neal J M,Logendra S.Elicitation,a new window into p lant chemodiversity and phytochemical drug discovery[J].JMed Chem,2003,5(12):2542-2547.

[6]刘建玲、陈宝宝、刘永红,等.半夏内生菌的分离与初步鉴定[J].中国中药杂志,2009,6(18):2305-2307.

Biodiversity of Endophytes from Astragalus M embranaceu

HU Qing,ZHU GE Zeng-yu,REN Chao
(College of Animal Science and Veterinary Medicine,Tianjin Agricultueal College,Tianjin 300384,China)

The aim of this study was to isolate the endophytes of Astragalus polycladus and screen their antimicrobial activi⁃ties.The experiment was conducted to isolate endophytes from healthy root of Astragalus polycladus under different conditions by means of organization screening,surface disinfection,control treatment,selection of culture medium,morphological identification, and so on.The morphological identification of the fungi and bacterium was studied.And then,morphological identification and Gram staining was performed.Results showed that there were 17 fungus and 34 bacteria isolated from Astragalus polycladus.Identi⁃fication of morphological characteristics under the microscope showed that endophytic fungi were classified to seven species.Identi⁃fied by Gram staining,there were 19 Gram-positive bacteria and 15 Gram-negative bacteria.P seudomonas sp.and Bacillus sp.are the main composition.The results showed that the dominant medium was beef extract peptone solid medium,witch supported 28 strains of microbes.The next was LB(Luria-Bertani)with 20,and Gao medium I with only three.

Astragalus polycladus;endophytes;biodiversity;bioactivity;isolation and identification Corresponding author:ZHU GE Zeng-yu

S895.4

A

0529-6005(2016)02-0059-02

2014-12-02

天津市教委科研计划项目(20120621)

胡青(1990-),女,本科,研究方向为动物医学, E-mail:805099964@qq.com

诸葛增玉,E-mail:zhugezy@163.com