大幅度提高马齿苋组培效率的培养环境条件优化

杨颜颜，云晶晶，杜建梅，杨心怡，王新风，陆长梅*（.南京师范大学生命科学学院，江苏南京003；.江苏省环洪泽湖生态农业生物技术重点实验室，淮阴师范学院，江苏淮安3300）

大幅度提高马齿苋组培效率的培养环境条件优化

杨颜颜1，云晶晶1，杜建梅1，杨心怡1，王新风2，陆长梅1*
（1.南京师范大学生命科学学院，江苏南京210023；2.江苏省环洪泽湖生态农业生物技术重点实验室，淮阴师范学院，江苏淮安223300）

为了提高马齿苋的组培效率，解决马齿苋出愈时间迟、愈伤组织诱导率不高、愈伤组织诱导需要使用2，4-D、不定芽增殖来源有限等问题，根据马齿苋的最适生长条件，将组织培养环境调整为温度（30依1）益、全光照，并从无菌苗上直接取材进行外植体培养。结果表明：种子在高温、全光照条件下萌发快，且无菌苗长势好。取材于无菌苗上的根、茎和叶均可以在不添加2，4-D的MS培养基中脱分化形成愈伤组织，且茎在MS垣NAA 1.0 mg/L垣6-BA 1.0 mg/L培养基中、叶在MS垣NAA 1.5 mg/L垣6-BA 0.5耀1.5 mg/L培养基中的初始出愈时间均提前至4 d，且诱导率均达到100%，愈伤组织长势旺盛。带腋芽的茎段在MS垣NAA 0.1 mg/L垣6-BA 5.0 mg/L培养基中可以直接分化出大量不定芽，增殖率达10.5。在最适光温环境下，马齿苋外植体出愈迅速，愈伤组织诱导率和不定芽增殖率大幅度提高。

马齿苋；高温；全光照；愈伤组织诱导；不定芽分化

马齿苋（Portulaca oleracea）为马齿苋科（Portu原lacease）马齿苋属（Portulaca）的1 a生肉质草本植物。其蛋白质含量高、氨基酸种类齐全、总黄酮含量丰富，还含有棕-3不饱和脂肪酸、钾素、去甲肾上腺素、褪黑激素等多种保健营养成分，具有改善血液循环、提高人体免疫力、防治心血管疾病、抑制微生物生长等多重功效[1耀3]。此外，马齿苋耐高温、干旱、高湿、高盐以及重金属污染等逆境的能力强大，又是非常好的生态修复植物[4]。马齿苋集保健、食用、药用、生态价值于一身，值得进一步研究与开发[5]。

20世纪90年代以来，国内外对马齿苋的研究集中在生药学及其所含的化学成分、生物活性物质、临床应用、多种保健食品的加工等方面[6耀11]。但是，如何利用现代生物技术对马齿苋进行有效的遗传改良并挖掘其潜在的利用价值尚少见报道[12]。王瑞聪等[13]曾利用化学诱变的方法进行马齿苋遗传改良，试图扩大种质资源。自2003年开始，国内多名学者[14耀16]对马齿苋的组织培养技术进行了研究，希望为马齿苋的遗传改良奠定基础。但综合分析现有的马齿苋组织培养技术，发现尚存在一些问题，如，愈伤组织诱导率不高，愈伤组织诱导多采用2，4-D导致后续不定芽分化相对较困难；外植体来源狭窄，主要是叶片；不定芽仅可以从愈伤组织诱导，周期较长等[14耀18]。为了更好地发展马齿苋资源特色，提高马齿苋的组织培养效率，我们从改变培养条件与培养马齿苋无菌苗入手，在扩大外植体来源、减少2，4-D使用量、增加不定芽来源渠道等方面，对马齿苋的快繁和再生技术进行了探索，以期为马齿苋的遗传改良、规模化繁殖和医药保健品原材料生产等研究奠定基础。

1　材料与方法

1.1试验材料

试验材料为野生型马齿苋种子，2013年9月下旬采自南京师范大学仙林校区植物园（东经118毅95忆、北纬32毅15忆）。

1.2试验方法

1.2.1无菌苗获得马齿苋干种子流水冲洗30 min—75%酒精浸泡30耀60 s—无菌水冲洗1次—0.1%的HgCl2溶液浸泡8 min—无菌水冲洗4次—吸干表面水分，然后接种到1/2MS培养基（蔗糖3%、琼脂0.9%、pH值5.8，下同）上，在温度（30依1）益、光照强度2 000耀3 000 lx、全光照条件下进行培养。记录种子萌发以及幼苗长至1 cm左右和长出4片真叶时所需的时间。

1.2.2愈伤组织诱导选择长出4片真叶的马齿苋无菌苗，分别以其叶片、下胚轴、根作为外植体，接种到MS垣NAA 1.0 mg/L垣6-BA 1.0 mg/L培养基中。接种后观察最早出愈时间和愈伤组织长势，第21 d时统计愈伤组织诱导率。分析不同器官产生愈伤组织能力的差异。

选择最佳外植体器官，分别接种到不同激素浓度配比的MS培养基中，试验激素浓度设NAA 0.5 mg/L垣6-BA 0.5 mg/L、NAA 1.0 mg/L垣6-BA 0.5 mg/L、NAA 1.5 mg/L垣6-BA 0.5 mg/L、NAA 1.0 mg/L垣6-BA 1.0 mg/L计4个处理，每处理接种80个。接种后第21 d，统计愈伤组织诱导率，观察愈伤组织长势。筛选最佳愈伤组织培养基配方。

为了扩大用于愈伤组织诱导的外植体来源，进一步扩大激素浓度配比，试验NAA和6-BA浓度均设0、0.5、1.0、1.5 mg/L，将2种激素按照配比配制成系列浓度处理的培养基，接种马齿苋叶片。观察马齿苋叶片在不同培养基中愈伤组织的诱导状况。

1.2.3不定芽增殖选择生长旺盛的愈伤组织，接种到MS垣NAA 0.5 mg/L垣6-BA 4.0 mg/L培养基中[17]，进行不定芽增殖，接种后第21 d观察外植体状态，统计不定芽增殖率。同时，选择生长21 d以上、节间展开的无菌苗，除去根系，保留植株的腋芽或顶芽，将长0.5 cm左右的外植体接种到不同激素浓度配比的培养基中，试验激素浓度设NAA 0.2 mg/L垣6-BA 5.0 mg/L、NAA 0.1 mg/L垣6-BA 5.0 mg/L、NAA 0.2 mg/L垣6-BA 4.0 mg/L、NAA 0.2 mg/L垣6-BA 6.0 mg/L计4个处理，每处理接种40个，接种后第21 d统计不定芽增殖率。分析不定芽在不同培养基中的增殖诱导情况。

1.2.4生根诱导将长度跃0.5 cm的不定芽，分别接种到MS垣NAA 0.0 mg/L、1/2MS垣NAA 0.0 mg/L、1/2MS垣NAA 0.5 mg/L、1/2MS垣NAA 1.0 mg/L培养基中，进行生根诱导。接种后第7 d，观察不定根长势，统计不定根诱导率。

2　结果与分析

2.1无菌苗获得

马齿苋播种后2耀3 d，开始有种子萌发；播种后7 d，无菌苗长至1 cm左右；播种后21 d时，多数幼苗长出4片真叶。

2.2愈伤组织诱导

2.2.1不同器官外植体对愈伤组织诱导的影响不同器官诱导产生愈伤组织的能力不同（表1）。接种后第4 d，下胚轴首先开始在两端膨大，并呈嫩绿色；接种后第7 d，叶片伤口处开始长出嫩绿色愈伤组织；接种后第10 d时，根两端开始长出嫩绿色愈伤组织。下胚轴不仅愈伤组织出现早，而且愈伤组织诱导率最高（100%），长势也最旺盛；叶片的愈伤组织诱导率次之；根的愈伤组织诱导率虽然最低，但也达到了89.3%，这与李焘等“胚根不能形成愈伤组织”的结论[14]截然不同。可以看出，马齿苋幼苗的叶片、下胚轴和根均可以作为外植体用来诱导形成愈伤组织，其中，用下胚轴诱导产生愈伤组织最快、生长最好。

表1　不同器官外植体对愈伤组织诱导的影响Table1　Effect of explants from different organs on the callus induction

表2　不同激素浓度配比对下胚轴愈伤组织诱导的影响Table2　Effects of different hormone combinations on the callus induction of hypocotyls

选择下胚轴作为外植体，接种到不同激素浓度配比配制的培养基中，以优化下胚轴诱导愈伤组织的培养基配方。结果（表2）显示，在4种培养基中，下胚轴均可以于接种后4 d左右诱导出愈伤组织，且诱导率均达到了100豫，但其后期的愈伤组织长势差异很大。在NAA 0.5 mg/L垣6-BA 0.5 mg/L和NAA 1.0 mg/L垣6-BA 1.0 mg/L处理的培养基中，浅绿色愈伤组织生长均旺盛，其中，NAA0.5mg/L垣6-BA0.5mg/L处理的愈伤组织上有少量不定芽形成；而NAA1.0 mg/L垣6-BA 1.0 mg/L处理的浅绿色愈伤组织表面长出浅白色愈伤组织，但不定芽较少出现。在NAA 1.0 mg/L垣6-BA 0.5 mg/L和NAA 1.5 mg/L垣6-BA 0.5 mg/L处理的培养基中，愈伤组织长势均相对较弱，其中，NAA 1.5 mg/L垣6-BA 0.5 mg/L处理的少数愈伤组织上长出了毛状根，这可能是NAA浓度偏高所致。

为了扩大愈伤组织诱导所用的外植体来源，以马齿苋叶片为外植体，进一步扩大培养基激素浓度进行配比，观察愈伤组织在不同培养基中的诱导状况。结果（表3）显示，在不添加激素的培养基中，叶片不能形成愈伤组织；在单一添加NAA处理的培养基中，叶片出愈时间延迟至9 d，愈伤组织呈淡黄色且生长缓慢，诱导率随NAA浓度的升高而升高；在单一添加6-BA处理的培养基中，叶片出愈时间为7 d，愈伤组织呈淡绿色且生长依然缓慢，诱导率随6-BA浓度的升高而逐渐降低；在同时添加NAA和6-BA的MS培养基中，叶片愈伤组织呈绿色且生长旺盛，其中，NAA 1.5 mg/L垣6-BA 0.5耀1.5 mg/L处理不仅出愈时间提早至4 d，而且诱导率也均达到了100%。

2.3不定芽增殖

将下胚轴和叶片来源的生长旺盛的愈伤组织接种到MS垣NAA 0.5 mg/L垣6-BA 4.0 mg/L培养基中诱导形成不定芽，增殖系数为10.2，与文献报导的较高的增殖系数[18]相当。这里不再赘述。

为增加不定芽来源，将带有腋芽的马齿苋茎段转接到不同激素浓度配比的培养基中进行不定芽增殖诱导，结果（表4）显示，带有腋芽的茎段在NAA 0.2 mg/L垣6-BA 5.0 mg/L和NAA 0.2 mg/L垣6-BA 4.0 mg/L培养基中没有不定芽增殖，但是茎伸长、增粗，其中直立扦插茎伸长和增粗显著；在NAA 0.2 mg/L垣6-BA 6.0 mg/L培养基中，有大量不能正常长大的不定芽形成；在NAA 0.1 mg/L垣6-BA 5.0 mg/L培养基中，不定芽可以正常长大，增殖率达到10.5。表明将带有腋芽的茎段扦插到不同激素浓度配比的培养基中可以分别进行壮苗和不定芽的增殖，其中，MS垣NAA 0.2 mg/L垣6-BA 4.0耀5.0 mg/L培养基适合于不定芽的壮苗培养，MS垣NAA 0.1 mg/L垣6-BA 5.0 mg/L培养基适合于不定芽的增殖。

2.4生根诱导

剪取长1 cm以上的不定芽，转接到不同的培养基中进行不定根诱导，结果（表5）显示，接种后第7 d，所有不定芽基部均长出不定根，其中，在不添加NAA的2种培养基中，不定根均可迅速长出，但数量少、根较细，且在1MS培养基中的生根数更少；在1/2MS培养基中，NAA添加浓度为0.5 mg/L时不定根数量中等且较粗壮，而NAA浓度增加到1.0 mg/L时不定根短小密集。可以看出，在试验的4种培养基中，1/2MS垣NAA 0.5 mg/L培养基最适合于马齿苋不定根的诱导。待幼苗长至3 cm以上时，常规炼苗移栽，成活率均能达到99%以上。

表3　不同激素浓度配比对叶片愈伤组织诱导的影响Table3　Effects of different hormone combinations on the callus induction of leaves

表4　不同激素浓度配比对茎段不定芽增殖的影响Table4　Effects of different hormone combinations on the on the adventitious buds proliferation from stems

表5　不同培养基组成对不定根诱导的影响Table5　Effects of different components of culture medium on the adventitious root induction

3　结论与讨论

3.1组培环境条件调整

现有马齿苋组织培养相关文献中的外植体来源有2种：一种是直接取材田间生长的植株[16，18，19]，另一种是利用种子做外植体获得无菌苗[14，15，17]。可能是由于田间采集的外植体不够幼嫩以及外植体需要彻底消毒从而影响外植体活性等缘故，导致田间取材的马齿苋外植体普遍出愈时间迟、出愈率不高[16，20，21]。而从无菌苗上取材时，虽然消除了消毒剂的影响，但仍需要使用2，4-D才能将愈伤诱导率在个别培养基上达到100%[17]。而2，4-D的使用对后续不定芽的分化极为不利。如何进一步提高愈伤组织诱导率和不定芽分化率是提高马齿苋组织培养效率的关键所在。

马齿苋属于C4兼性CAM植物，其仅在30益以上时萌发迅速、高光强全光照条件下生长旺盛[17，20]。李贞霞等[21]的研究也显示，马齿苋在30益时愈伤组织长势旺盛。而现有文献报道的组培条件多数是温度25益、光照时间16h。是否是因为环境温度和光照条件的不适合而导致组培效率不高？鉴于此，我们将培养环境条件调整为温度（30依1）益、全光照，并且从无菌苗的培养入手，进行马齿苋的快繁和再生体系建立研究。无菌苗阶段的研究结果显示，该条件下，播种7 d后，马齿苋无菌苗就能长至1 cm，可以进行外植体取材。

3.2愈伤组织诱导

以温度（30依1）益、全光照下生长的马齿苋无菌苗的各个器官作为外植体，接种到MS垣NAA 1.0 mg/L垣6-BA 1.0 mg/L培养基中。在不使用2，4-D、不改变其他培养条件下，下胚轴的出愈时间提早至4 d，较刘红梅等[17]应用2，4-D的下胚轴出愈时间提早了4 d，愈伤诱导率也提高到100%；其次，叶片的愈伤诱导率虽然没有达到100%，但也达到了98%，较前人的研究结果大大提高，而且在培养基优化为MS垣NAA1.5mg/L垣6-BA 0.5耀1.5 mg/L后初始出愈时间亦提早至4 d、诱导率也提高到100%；第三，尚无文献显示马齿苋根可以诱导出愈伤组织，但在本研究中，马齿苋根的愈伤诱导率也达到了89.3%，只是出愈时间较晚、愈伤组织长势较慢。

目前，绝大多数植物组织培养的光温条件控制在光照时间16 h、温度（25依1）益。诚然，多数植物比较适应这个条件，但本研究结果提示，对一些目前组培效率尚不高的植物，也许从该植物自然生长时的最佳生长条件考虑，可能就会得到意想不到的结果。

3.3不定芽诱导

组织培养中获得不定芽的常见途径有2种：一种是外植体先经脱分化形成愈伤组织，再经再分化形成不定芽；另一种是外植体直接形成不定芽。其中，第2种方式由于缺少了易导致变异的愈伤组织诱导和形成阶段，不仅试验成本和时间大为缩短，而且对于需要保持母本遗传性状的快繁和再生体系建立极为有利。鉴于现有马齿苋组培研究中不定芽的增殖均是基于愈伤组织诱导后再分化形成[18]，于是，作者利用带有腋芽的茎段探讨能否直接形成不定芽。结果显示，由腋芽直接增殖不定芽是可行的，而且利用MS垣NAA 0.1 mg/L垣6-BA 5.0 mg/L培养基可以直接在较短的时间内将增殖率达到10以上。虽然这一增殖率尚较文献报道的愈伤组织再生芽的最高增殖率为13.4和12.5[17，19]略低，但由于大大缩短了试验进程，越过了变异易发阶段，因此，在实际应用中应有更大的利用价值。

综上所述，确定马齿苋的最佳组织培养条件是：组织培养环境条件为温度（30依1）益、全光照；首先在1/2MS培养基中常规接种培养无菌苗；7 d后，无菌苗的根、茎、叶均可用于愈伤组织诱导；茎在MS垣NAA 0.5 mg/L垣6-BA 0.5 mg/L培养基中、叶片在MS垣NAA 1.5 mg/L垣6-BA 0.5耀1.5 mg/L培养基中的最早出愈时间均为4 d，愈伤诱导率均为100%，且愈伤组织长势旺盛；愈伤组织在MS垣NAA 0.5 mg/L垣6-BA 4.0 mg/L培养基中可诱导形成不定芽；带顶芽或腋芽茎段在MS垣NAA 0.2 mg/L垣6-BA 4.0耀5.0 mg/L培养基中进行壮苗培养，在MS垣NAA 0.1 mg/L垣6-BA 5.0 mg/L培养基中进行不定芽增殖，不定芽增殖率可达10.5；待不定芽长至1 cm以上时，在1/2MS垣NAA 0.5 mg/L培养基中进行生根诱导，生根率可达到100%，且不定根数量多、粗壮。马齿苋愈伤组织诱导和不定芽增殖快速增加的原因，可能与高温、全光照条件更适合马齿苋的生长有关。深层次原因尚待进一步探讨。

［1］Simopoulos AP，Tan Dunxian，Manchester L C，Reiter RJ.Purslane：a plant source of omega-3 fatty acids and melatonin［J］.Journal of Pineal Research，2005，39（3）：331-332.

［2］Feng PC，Haynes LJ，Magnus KE.High concentration of（-）-noradrenaline in Portulaca oleracea L.［J］.Nature，1961：191：1108.

［3］Sauer LA，Dauchy RT，Blask DE.Polyunsaturated fatty acids，melatoninandcancerprevention［J］.Biochem Pharmacol，2001，61（12）：1455-1462.

［4］Tiwari KK，Dwivedi S，Mishra S，Srivastava S，Tripathi RD，Singh NK，Chakraborty S.Phytoremediation efficien原cy of Portulaca tuberosa Rox and Portulaca oleracea L. naturally growing in an industrial effluent irrigated area in Vadodra，Gujrat，India［J］.Environmental Monitoring and Assessment，2008，147（1-3）：15-22.

［5］孙昌禹，王秀萍，刘雅辉，张国新.马齿苋开发利用现状及发展前景［J］.河北农业科学，2009，13（4）：76-77，88.

［6］Siriamornpun S，Suttajit M.Microchemical components and antioxidant activity of different morphological parts of Thai Wild Purslane（Portulaca oleracea）［J］.Weed Sci，2010，13（4）：182-188.

［7］Lim YY，Quah EPL.Antioxidant properties of different cultivars of Portulaca oleracea［J］.Food Chem，2007，103（3）：734-740.

［8］AEA Moneim.Theneuroprotectiveeffects of purslane（Portulaca oleracea）onrotenone-inducedbiochemical changes and apoptosis in brain of rat［J］.CNS&Neuro原logical Disorders Drug Targets，2013，12（6）：830-841.

［9］王玮，郭利朋.马齿苋保健蔬菜纸的研制［J］.河北农业科学，2007，11（1）：111-112，124.

［10］牛美兰，田恒运，马俊远.马齿苋口服液对高脂大鼠LEP、ADPN、TC、TG、ALT、AST水平的影响［J］.中国老年学杂志，2016，36（1）：38-39.

［11］李勇.马齿苋提取物冻干粉软胶囊工艺技术研究［J］.食品工业，2011，32（5）：29-32.

［12］Alam MA，Juraimi AS，Rafii MY，Hamid AA，Uddin MK，Alam MZ，Latif MA.Genetic improvement of Purslane（Portulaca oleracea L.）andits future prospects［J］. Molecular Biology Reports，2014，41（11）：7395-7411.

［13］王瑞聪，张源，杨颜颜，孙林华，陆长梅.NaN3处理马齿苋种子的最适剂量与叶绿素荧光辅助筛选的方法［J］.江苏农业科学，2015，43（9）：224-228.

［14］李焘，王喆之.马齿苋组织培养及植株再生系统的建立［J］.陕西师范大学学报：自然科学版，2003，31（2）：95-98.

［15］邱宁宏，周丹丽，韩露.马齿苋的组织培养与快速繁殖［J］.中国野生植物资源，2003，22（2）：58.

［16］黄群策，贾宏汝，王红艳.马齿苋植物的无性系及其植株再生体系［J］.北方园艺，2007，（2）：142-145.

［17］刘红梅，蒋继志，宫卫波，李丽，廖祥儒.马齿苋组织培养的优化［J］.华北农学报，2006，21（S1）：63-66.

［18］王红艳，黄群策，秦广雍，霍裕平.马齿苋的组织培养和植株再生［J］.河南农业科学，2006，（5）：84-87.

［19］黄红梅，彭超宇，刘树玲，赵燕，刘清波.马齿苋离体培养再生体系的建立［J］.中国农学通报，2011，27（22）：136-141.

［20］杨子仪.野生型与栽培型马齿苋种子的萌发特性和抗逆性比较［D］.南京：南京师范大学，2014.

［21］李贞霞，董卫华，陈碧华.马齿苋组织培养研究［J］.贵州农业科学，2008，36（3）：16-17.

Optimization of Culture Conditions for Greatly Improving the Tissue Culture Efficiency of Purslane

YANG Yan-yan1，YUN Jing-jing1，DU Jian-mei1，YANG Xin-yi1，WANG Xin-feng2，LU Chang-mei1*
（1.College of Life Sciences，Nanjing Normal University，Nanjing 210023，China；2.Jiangsu Key Laboratory for Eco-Agricultural Biotechnology around Hongze Lake，Huaiyin Normal University，Huaian 223300，China）

In order to improve the tissue culture efficiency of purslane，the problems，such as late callus formation，low rate of callus induction，requiring the use of 2，4-D in callus induction，and limited source of explants for adventitious buds proliferation etc.should be solved.According to the optimal growth conditions for purslane，its tissue culture environment was adjusted to（30依1）益of temperature and full light exposure，and explants were taken directly from the sterile seedlings.The results showed that seeds germinated well and aseptic seedlings grew fast under this condition.Callus could be induced from each organ of aseptic seedlings on MS垣NAA 1.0 mg/L垣6-BA 1.0 mg/L medium without the addition of 2，4-D.Callus could be first found on the stems in 4 d and the callus grew very fast.After further adjust原ment for hormones，callus could be induced a hundred percent in 4 d from leaves on MS垣NAA 1.5 mg/L垣6-BA 0.5-1.5 mg/L medium.A large number of adventitious buds could be induced from stems with axillary buds on MS垣NAA 0.1 mg/L垣6-BA 5.0 mg/L medium with a proliferation rate of 10.5.Under the optimum temperatureandlightenvironment，callusfrom purslane explants could be induced early.The cal原lus grew fast，and its induction rate together with proliferation rate of adventitious buds were higher.

Purslane；High temperature；Full light exposure；Callus induction；Bud differentiation

Q647

A

1008-1631（2016）02-0043-05

2015-06-24

国家基础科学人才培养基金项目（J1103507）；国家基础科学人才培养基金项目（J1210025）；江苏省环洪泽湖生态农业生物技术重点实验室开放课题(HZHL1504)；江苏省大学生创新项目

杨颜颜(1990-)，女，山东泰安人，硕士研究生在读，主要从事植物资源与环境相关研究。E-mail：1370636774@qq.com。

陆长梅（1969-），女，江苏海安人，副教授，博士，主要从事植物资源与环境相关的教学和研究工作。E-mail：luchangmei@njnu.edu.cn。