人HP1α/pEGFP-N1真核表达载体的构建及其表达和定位*

吴婷，杨茂，何涛，杨文理,2

（西南医科大学基础医学院:1肿瘤医学研究所；2生物化学教研室,四川泸州646000）

人HP1α/pEGFP-N1真核表达载体的构建及其表达和定位*

吴婷1，杨茂1，何涛1，杨文理1,2

（西南医科大学基础医学院:1肿瘤医学研究所；2生物化学教研室,四川泸州646000）

目的：用增强型绿色荧光蛋白作为标记物，观察人类异染色质相关蛋白HP1α在HeLa细胞中的表达及定位。方法：用RT-PCR方法扩增获得HP1α基因编码序列，将其定向克隆至含增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescence protein, EGFP）的真核表达载体pEGFP-N1中，构建HP1α/pEGFP-N1荧光蛋白融合基因表达载体。并由脂质体介导将其转染HeLa细胞，荧光显微镜观察其表达情况及亚细胞定位。结果：双酶切与测序结果表明目的基因序列完全正确；荧光观察结果证实HP1α主要存在于细胞核内。结论：成功构建了目的基因HP1α的真核表达载体，并在HeLa细胞中获得有效表达和定位。

异染色质相关蛋白；绿色荧光蛋白；基因表达定位；HeLa细胞

HP1α（heterochromatin protein 1 homolog alpha）是异染色质相关蛋白1家族成员之一，在进化上高度保守[1-2]。人类HP1α的编码基因位于染色体12q13.13的染色盒同源物5（chromobox homolog,CBX5）[1-2]。有资料显示，HP1α与人类多种肿瘤密切相关，如乳腺癌[2-4]，甲状腺癌[5]，前列腺癌[6-7],肾癌[8]。HP1α参与肿瘤发生、发展、浸润和转移，在这些过程中起着重要的作用，使得HP1α可能作为肿瘤的预测靶点和治疗预后观测指标。但是，HP1α对宫颈癌细胞HeLa生物学行为的影响目前尚不清楚，深入研究HP1α在宫颈癌发生发展中的作用及其机制具有重要作用。因此，我们构建了可表达EGFP（增强型绿色荧光蛋白）标签的HP1α基因真核表达载体HP1α/ pEGFP-N1，并将其转染宫颈癌细胞，对HP1α在细胞内的表达和定位进行了初步的研究。

1 材料和方法

1.1 材料

组织标本取自意外死亡健康成人肝脏组织（已获家属知情同意）。ReverTra Ace逆转录酶，Oligo（dT）购自TOYOTO公司；Rasin、限制性核酸内切酶和DNA分子量标准购自大连宝生物公司；AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒购自AxyPrep公司；BioFlux质粒小量提取试剂盒购自BioFlux公司；IPTG、X-gal、琼脂糖（Agarose）购自Sigma公司；HeLa细胞株购自四川大学华西医学中心移植免疫研究室；脂质体Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司；RPMI1640培养基购自GIBCO公司；大肠杆菌DH5α为本室保存。引物合成和质粒的测序均在上海Invitrogen公司进行。

1.2 方法

1.2.1 组织总RNA的制备及引物设计

采用异硫氰酸胍/苯酚/氯仿一步法提取组织总RNA，作为RT-PCR模板。根据已知HP1α基因的mRNA全长序列（GenBank登录号GI∶6912291），在编码区序列两侧设计引物，分别加上PstⅠ和Bam HⅠ的酶切位点，并去掉3’端终止密码，扩增产物长度为570bp。引物序列如下：

1.2.2 HP1α基因全长编码区的扩增

逆转录反应体系为：5×RT buffer（25 mM Mg-Cl2）4 μL，dNTP Mix（各10 mmol/L）2 μL，RNase Inhibitor（10 U/μL）1 μL，Oligo（dT）（10 pmol/μL）1 μL，总RNA（100 ng/μL）2 μL，ReverTra Ace（100 U/ μL）1 μL，0.1%DEPC处理水9 μL，混匀，总体积为20 μL。逆转录在PCR仪上进行。条件为：42℃20 min，94℃5 min，4℃5 min，瞬间离心，-20℃保存备用。以逆转录生成的cDNA为模板进行HP1α基因全长编码区的的扩增。PCR反应体系：10×Pyrobest buffer 5 μL，dNTP Mix（2.5 mmol/L）4 μL，上游引物（10 pmol/L）1 μL，下游引物（10 pmol/L）1 μL，模板2 μL（约0.1 μg），Pyrobest酶（5 U/μL）0.5 μL，混匀，反应总体积为50 μL。扩增条件为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s；30个循环后72℃延伸7 min。取扩增产物5 μL于10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定，再以相同条件扩增、胶回收目的片段。

1.2.3 真核表达载体HP1α/pEGFP-N1的构建与鉴定

将HP1α目的片段，定向克隆至真核表达载体pEGFP-N1中。以PstⅠ和Bam HⅠ分别双酶切质粒pEGFP-N1和HP1α目的片断，胶回收纯化后再将二者以1∶3～10（摩尔比）混合。16℃连接过夜，转化感受态细胞DH5α，涂板于卡那霉素阳性的LB琼脂平板，37℃培养12～14 h。挑取单克隆，37℃，230 rpm/h,培养6～8 h，小量抽提质粒，PstⅠ/Bam HⅠ双酶切鉴定，并将阳性克隆送测序。测序正确的阳性克隆命名为HP1α/pEGFP-N1，并大量提取质粒，用于细胞转染。

1.2.4 细胞培养和实验分组

人宫颈癌细胞系HeLa用RPMI1640培养液（含10%新生牛血清，100 U/mL的青霉素/链霉素）常规培养（5%CO2，37℃，饱和湿度）、传代。实验分为两组，对照组：转染空质粒pEGFP-N1；实验组：转染重组质粒HP1α/pEGFP-N1。

1.2.5 细胞转染

将对数生长期的HeLa细胞接种于六孔细胞培养板（1×105个细胞/孔），细胞生长至80%融合时，按如下方法进行瞬时转染：每孔2.4 μg质粒DNA和6 μL脂质体Lipofectamine 2 000。首先取6 μL脂质体加入244 μL无血清、无抗生素的RPMI1640培养基中，轻柔混匀，室温放置5 min，即为溶液A；再取2.4 μg质粒pEGFP-N1或HP1α/pEGFP-N1加入无血清、无抗生素的RPMI1640培养基中，终体积250 μL，混匀，即为溶液B。将溶液A逐滴加入溶液B，轻柔混匀，室温放置20～30 min；然后将混合物逐滴加入各孔，再以不含血清和抗生素的RPMI1640培养基补足2 mL/孔。37℃培养5 h后，换为RPMI1640全培养基（含10%新生牛血清和100 U/mL的青霉素/链霉素）继续培养。

1.2.6 荧光显微镜观察

转染48 h后，荧光显微镜（Olympus）下观察HP1α/pEGFP-N1在HeLa细胞中的表达和定位情况并拍照。

2 结果

2.1 真核表达质粒HP1α/pEGFP-N1的构建

人HP1α基因全长编码区的PCR扩增产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳，可见约570 bp的特异性目的条带（图1），与预期的结果一致。目的条带定向克隆至pEGFP-N1载体，双酶切后电泳可见约570 bp的插入片段（图2）。测序结果证实，插入片段序列与HP1α mRNA编码序列完全一致（图3），且插入方向正确。

图1 目的基因HP1α的PCR产物

图2 重组质粒HP1α/pEGFP-N1的构建和鉴定

图3 重组质粒HP1α/pEGFP-N1的测序图谱

2.2 荧光显微镜计数转染效率

以pEGFP-N1空载体为对照组，将HP1α/ pEGFP-N1真核表达质粒瞬时转染HeLa细胞。48 h后荧光显微镜镜下观察，可见对照组细胞有较强的绿色荧光，阳性率约60%（见图4 a,4 b），说明Lipofectamine 2 000介导的质粒转染HeLa细胞的效率较高。实验组细胞也有较强的绿色荧光，但阳性率较低，约30%（见图4 c,4 d）。

图4 重组质粒HP1α/pEGFP-N1在HeLa细胞中的转染效率和表达（×100）

2.3 HP1α/pEGFP-N1重组质粒在HeLa细胞中的表达和定位

对照组（pEGFP-N1）和实验组（HP1α/pEGFPN1）细胞均有较强的绿色荧光蛋白表达，在对照组中，GFP蛋白产生的荧光均匀地分布于整个细胞的细胞质和细胞核中（图5 a）。而实验组细胞中，荧光主要聚集在细胞核内（图5 b），表明该细胞表达了人HP1α/GFP融合蛋白，并且HP1α蛋白主要在核内表达。

图5 HP1α在HeLa细胞中的表达和定位（×200）

3 讨论

异染色质相关蛋白1（heterochromatin protein 1, HP1）是一个庞大的蛋白质家族，最早在果蝇中发现，它在进化上高度保守，几乎存在于所有真核生物，从裂殖酵母、植物到人类[1-2]。HP1蛋白家族由一系列称为染色盒（chromobox,CBX）的基因编码，在哺乳动物HP1蛋白家族有HP1α、HP1β、HP1γ三种异构体。HP1蛋白的序列和结构可分为三部分：N-端的染色域（chromodomain）——结合基因沉默的表遗传标志[1,2]即第9位赖氨酸二或三甲基化的组蛋白H3（Di-met-H3K9,Tri-met-H3K9）；C-端染色阴影域（chromoshadow domain）——参与同、异二聚化并与其他蛋白质相互作用；中间的可变铰链区——包含核定位序列。哺乳动物细胞中，HP1α主要定位于异染色质区，其最常见功能是参与异染色质形成，并通过与甲基化的H3K9结合间接或直接与几个非组蛋白相互作用发挥多种功能：从转录调节、染色质修饰和复制到DNA修复、细胞核构建和染色体维持等多方面参与细胞过程[1-2、9]。在肿瘤的发生、发展中起重要作用，了解HP1α的亚细胞定位将有助于对其的功能的深入研究。

本研究中以正常成人肝组织总RNA为模板，在人HP1α上游引物加入PstⅠ酶切位点，下游引物加入Bam HⅠ酶切位点并去除HP1α基因3’末端的终止密码。通过RT-PCR扩增获得目的基因，并通过分子克隆技术将HP1α cDNA置于EGFP基因的上游，与之形成融合蛋白。所用的表达载体pEGFP-N1可编码增强型绿色荧光蛋白（EGFP），它是由绿色荧光蛋白（GFP）中65位丝氨酸被苏氨酸取代、64位苯丙氨酸被亮氨酸取代而形成的突变体。EGFP在动物细胞中表达量更高，经488 nm紫外光激发可产生荧光强度更强的绿色荧光[10]，可以直接在荧光显微镜下观察目的基因在活体中的表达而不必破坏组织细胞或添加底物。因此，EGFP作为一种良好的报告基因和筛选标记，在基因表达与调控、细胞分化及蛋白质的胞内定位[11]与功能转化等多种研究中得到广泛应用[12]。

在研究中我们还发现,HP1α/EGFP融合蛋白在瞬时转染后的表达效率比单独的EGFP更低，荧光强度更弱。pEGFP-N1质粒瞬时转染HeLa细胞后12 h即有表达，而HP1α/EGFP融合蛋白在细胞转染24 h后才看到其低水平表达，并且表达效率更低。我们推测可能是由于HP1α与EGFP形成的融合蛋白，在空间结构上可能存在相互作用，影响了蛋白的正确折叠而导致转染效率下降。

总之,本研究构建了HP1α/pEGFP-N1真核表达质粒，以增强型绿色荧光蛋白EGFP作为HP1α蛋白在HeLa细胞中表达和定位的标签，为进一步研究该基因在宫颈癌发生发展中的作用及其机制提供了有力的手段。

1．Vad-Nielsen J,Jakobsen KR,Daugaard TF,et al.Regulatory dissection of the CBX5 and hnRNPA1 bi-directional promoter in human breast cancer cells reveals novel transcriptvariantsdifferentiallyassociatedwithHP1α down-regulation in metastatic cells[J].BMC Cancer,2016, 16:32-52.

2．Vad-Nielsen J,Nielsen AL.Beyond the histone tale: HP1α deregulation in breast cancer epigenetics[J].Cancer Biol Ther,2015,16（2）:189-200.

3．Lin FM,Kumar S,Ren J,et al.SUMOylation of HP1α supports association with ncRNA to define responsiveness of breast cancer cells to chemotherapy[J].Oncotarget,2016, 7（21）:30336-30349.

4．Thomsen R,Christensen DB,Rosborg S,et al.Analysis of HP1α regulation in human breast cancer cells[J].Mol Carcinog,2011,50（8）:601-613.

5．Tretiakova MS,Bond SD,Wheeler D,et al.Heterochromatin protein 1 expression is reduced in human thyroid malignancy[J].Lab Invest,2014,94（7）:788-795.

6．Itsumi M,Shiota M,Yokomizo A,et al.Human heterochromatin protein 1 isoforms regulate androgen receptor signaling in prostate cancer[J].J Mol Endocrinol,2013,50（3）:401-409.

7．Shapiro E,Huang H,Ruoff R,et al.The heterochromatin protein 1 family is regulated in prostate development and cancer[J].J Urol,2008,179（6）:2435-2439.

8．Han B,Ziober A,Lu S,Bing Z.The expression of heterochromatin protein 1α/β in the kidney tumors:a microarray immunohistochemical study[J].Ann Diagn Pathol, 2013,17（2）:172-175.

9.De Koning L,Savignoni A,Boumendil C,et al.Heterochromatin protein 1α:a hallmark of cell proliferation relevant to clinical oncology[J].EMBO Mol Med,2009,1（3）:178-191.

10．Cormack BP,Valdivia RH,Falkow S,et al.FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein（GFP）[J]. Gene,1996,173（1 Spec No）:33-38.

11．Dardalbon V,Noraz N,Boyer M,et al.Green fluorescent protein as a selectable marker of fibronectin-facilitated retroviral gene transfer in primary human T lymphocytes[J]. Hum gene ther,1999,10（1）:5-14.

12．Zolotukhin S,Potter M,Hawswirth WW,et al.A"humanized"green fluorescent protein cDNA adapted for high-level expression in mammalian cells[J].J Virol,1996, 70（7）:4646-4654.

（2016-05-16收稿）

Construction and expression of human pEGFP-N1-HP1α in eukaryotic cells

Wu Ting1,Yang Mao1,He Tao1,Yang Wenli1,21Institute for Cancer Medicine,2Department of Biochemistry and Molecular Biology,School of Preclinical Medicine,Southwest Medical University,Luzhou,Sichuan Province 646000,China

Objective：To observe the expression and localization of human HP1α,an eukaryotic expression vector HP1α/EGFP-N1 was constructed and introduced into HeLa cells.Methods：HP1α cDNA were obtained by RT-PCR,and cloned into the eukaryotic expression vector pEGFP-N1 to construct HP1α/EGFP-N1 that was transfected into HeLa cells with Lipofectamine 2000.The expression and location of HP1α in transfected cells was detected by fluorescence microscope.Results：Diagnostic restriction digestion and sequencing analysis verified the identity of the plasmid,HP1α/EGFP-N1.After transfection,HP1α is localized in the nucleus of HeLa cells. Conclusion：Eukaryotic expression plasmid,HP1α/EGFP-N1 is successfully constructed and expressed effectively in HeLa cells.

HP1α;Enhanced green fluorescent protein（EGFP）;Gene expression;HeLa cells

R78

A

10.3969/j.issn.1000-2669.2016.06.012

*四川省教育厅科研基金资助项目（川教函[2011]538号）

吴婷（1989-），女，研究实习员，硕士

杨文理（1975-），女，副教授，博士。E-mail：ywl0621@163.com