乳酸脱氢酶突变体D-LDHY52L在大肠杆菌中的重组表达及其合成D-苯基乳酸的研究

蒋卓越，季伟，钱蓓蓓，朱益波*，齐斌

1(苏州大学 基础医学与生物科学学院,江苏 苏州,215123)2(常熟理工学院 苏州市食品生物技术重点实验室 发酵工程技术研究中心,江苏 常熟,215500)



乳酸脱氢酶突变体D-LDHY52L在大肠杆菌中的重组表达及其合成D-苯基乳酸的研究

蒋卓越1，季伟2，钱蓓蓓2，朱益波2*，齐斌2

1(苏州大学 基础医学与生物科学学院,江苏 苏州,215123)2(常熟理工学院 苏州市食品生物技术重点实验室 发酵工程技术研究中心,江苏 常熟,215500)

LactobacilluspentosusD-乳酸脱氢酶的三维构象表明氨基酸序列中第52位的酪氨酸非常接近底物酮酸盐C3位上的基团。该研究利用定点突变技术将第52位的亲水性的酪氨酸替换成疏水性的亮氨酸，有效提高了D-乳酸脱氢酶对底物苯丙酮酸的催化活力。在大肠杆菌中重组表达后，利用重组菌全细胞转化苯丙酮酸合成D-苯基乳酸。结果表明，D-苯基乳酸的产量比未突变菌株提高了46%，产量达18.47 g/L，转化率达65.96%。

D-乳酸脱氢酶; 定点突变;重组表达;苯丙酮酸;D-苯基乳酸

D-苯基乳酸(phenyllactic acid,PLA)即2-羟基-3-苯基丙酸，作为一种新型的广谱抗菌物质,具有分子量小，稳定性高,溶解性好等优点[1-2]。D-苯基乳酸在较低浓度时就能有效地抑制大部分食品腐败菌,其抑菌活性强于一些常用的食品防腐剂,如苯甲酸钠、山梨酸钾等[3-5]。D-苯基乳酸作为乳酸菌的代谢产物，即苯丙氨酸经转氨反应生成苯丙酮酸，进而脱氢合成苯乳酸,是天然的抗菌物质，在食品工业中具有广阔的应用前景[6-8]。

目前，D-苯基乳酸的合成方法主要有化学合成法和生物合成法，但由于化学合成法存在污染环境，技术复杂，产物不纯等缺点，生物合成法受到更多研究者的青睐[9]。2000年，Lavermicocca等通过对乳酸杆菌的研究，首次报道了乳酸菌Lactobacillusplantarum21B的发酵培养液中含有苯基乳酸[10]。随后，研究人员发现数量众多的乳酸菌具备合成PLA的能力。近几年陆续有文献报道其他的微生物如Bacilluscoagulans[11]、Geotrichumcandidum[12]和Rubrivivaxbenzoatilyticus[13]也能够合成PLA，其中ZHAO[11]报道的1株嗜热芽孢杆菌B.coagulansSDM，产苯基乳酸量达到37.2 g/L。这是目前报道的苯基乳酸产量最高的菌株。 随着生物技术的发展，基因工程定向改造微生物得到越来越多研究人员的关注。赵明月等[14]将D-乳酸脱氢酶和甲酸脱氢酶克隆到大肠杆菌中过表达，经转化条件的优化，苯基乳酸产量累积达18.92 g/L。这是目前大肠杆菌作为宿主转化生成苯基乳酸产量最高的菌株。

ISHIKURA等[15]和TOKUDA等[16]研究表明，LctobacillauspentosusD-乳酸脱氢酶的三维构象表明氨基酸序列中第52位的亲水的酪氨酸非常接近底物酮酸盐的C3位上的取代基，和底物的识别有紧密相关,将52位的酪氨酸替换成疏水的氨基酸能显著提高底物对苯丙酮酸的亲和力和催化活力。本研究利用基因工程技术，将来自L.plantarum的D-ldh通过定点突变，将氨基酸序列中52位的亲水的酪氨酸突变成疏水的亮氨酸，随后将突变基因转入大肠杆菌体内过表达，以苯丙酮酸为底物，全细胞合成D-苯基乳酸。通过对转化条件的优化，D-苯基乳酸的产量比未突变菌株有显著提高。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1主要试剂

D-苯基乳酸和苯丙酮酸标品，国药集团；酵母提取物、胰蛋白胨，Oxoid公司(英国)；DNA 聚合酶,硫酸卡那和相关分子试剂盒，上海生工；定点突变试剂盒、限制性内切酶，大连宝生物公司(TaKaRa)，所有实验试剂如果无特殊说明均为分析纯。

1.1.2菌种和质粒

Lactobacillusplantarum(CGMCC:1.2437)，中国菌种保藏中心(CGMCC)；pMD19-T Simple Vector，宝生物公司(大连)；E.coliDH5α，E.coliJM109，E.coliBL21(DE3),pET-28a(+)均为实验室保藏。

1.1.3主要仪器

PCR扩增仪、水平电泳系统、垂直电泳系统、凝胶成像系统，美国Bio-RAD公司；高速台式离心机，德国Thermo公司；恒温金属浴，德国Eppendorf公司；高效液相色谱仪，日本岛津公司；恒温振荡培养箱，太仓市华美生化仪器厂。

1.2方法

1.2.1基因片段的克隆，定点突变和质粒的构建

乳酸脱氢酶基因来自于植物乳杆菌CGMCC(1.2437)，以其基因组为模板，PCR扩增获得乳酸脱氢酶基因,扩增所用引物序列如下：

上游引物(含BamHI酶切位点)：

P1:CGCGGATCCATGAAAATTATTGCATATGC

下游引物(含HindIII酶切位点)：

P2:CCCAAGCTTTTAATCAAACTTAACTTGTG

纯化后的克隆产物经T4连接酶连入pMDTM19-T，然后将构建pMD-ldh质粒导入DH5α体内。质粒pMD-ldh在菌体内大量克隆后经快切酶BamHI-HindIII酶切后与经过同样酶切的质粒载体pET-28a连接，重组质粒pET-28a-ldh构建成功。

目的基因的定点突变根据TaKaRa MutanBEST Kit试剂盒指示操作，以重组质粒pET-28a-ldh为模板，P3，P4为引物进行PCR扩增，将氨基酸序列中的酪氨酸替换为亮氨酸，获得带有突变位点的重组质粒pET-28a-D-ldhY52L。

引物序列如下：

P3 :5-CCTTTTGTTGAGCTACATCGGCACCGT￣C￣G￣A￣A￣G￣C

P4 :5-TGCCGATGTAGCTCAACAAAAGGACTA￣T￣A￣C￣T￣G￣C

将重组质粒pET-28a-D-ldhY52L转入感受态大肠杆菌 BL21 (DE3) 体内，命名为BL21 (DE3)/ pET-28a-D-ldhY52L。转化子分别经菌落PCR验证、质粒酶切验证(如图1所示)和测序验证确保获得正确质粒。

1.2.2乳酸脱氢酶活力的测定

将活化的重组菌E.coliBL21(DE3)/pET-28a-D-ldh，E.coliBL21(DE3)/ pET-28a-D-ldhY52L和空载体对照E.coliBL21(DE3)/pET-28a(+) 按 1%的接种量接种到装有100 mL LB 液体培养基 (含50 mg/L卡那霉素) 的摇瓶中，37 ℃、200 r/min 恒温振荡培养至 OD600值为0.6～0.8后，添加IPTG至0.6 mmol/L，25 ℃诱导4 h后，取一定量的菌体离心洗涤后，稀释至OD600=1，取1 mL的菌体离心后加入500 μL的B-PER试剂，充分混匀后30 ℃裂解10 min，之后12 000 r/min离心10 min，取适量上清液进行乳酸脱氢酶酶活测定。基本原理是NADH在340 nm处有最大吸收峰，通过光吸峰值的改变定量测定酶的含量。乳酸脱氢酶检测的标准液为：0.1 mol/L磷酸缓冲液(pH为7.0),10 mmol/L丙酮酸或苯丙酮酸钠，0.4 mmol/L的NADH。反应在30 ℃连续测定反应液3 min在340 nm吸收值的变化。酶活定义为：在30 ℃,pH 7.0的条件下，每分钟消耗1 μmol NADH所需的酶量为1个酶活单位(1 μmol/min=1 U)。比活力定义为：每毫克粗酶蛋白中酶单位的数量(U/mg)。蛋白质质量分数的检测参照Bradford的标准方法。

1.2.3重组菌的全细胞转化生成D-苯基乳酸条件的优化

采用单因素实验在摇瓶中考察不同的转化温度(20，25，30，35 ℃)，诱导剂浓度(0.1，0.2，0.4，0.6，0.8 mmol/L)，诱导时间(4，6，8，10 h)和pH(6.5，7，7.5，8)对突变菌株全细胞合成D-苯基乳酸的影响。重组大肠杆菌基础诱导条件:OD600值为0.6时添加IPTG至0.6 mmol/L, 25 ℃诱导4 h。将菌体于4 ℃，6 000 r/min离心10 min, 收集菌体用 pH7.0 PBS洗涤2次,重悬于10 mL转化培养基中(pH 7.0的100 mmol/L的磷酸钾溶液溶有7.5 g/L苯丙酮酸),37 ℃，200 r/min转化30 min后取样用高效液相色谱检测转化产物。

1.2.4摇瓶中流加转化

在最优的诱导条件和转化条件下,将菌体悬浮于50 mL转化液,菌体干重20 g，苯丙酮酸和葡萄糖起始浓度分别为 6 g/L，20 g/L。分别在0.5，1，1.5，2.5 h添加0.2 g的苯丙酮酸钠,在4，5，6 h添加0.1 g苯丙酮酸钠，定时取样。

1.2.5高效液相色谱检测

苯丙酮酸钠，D-苯基乳酸和葡萄糖的检测:取一定量转化液于 4 ℃，12 000 r/min 离心 20 min，上清液稀释适当倍数，经0.22 μm滤膜过滤后高效液相(岛津，LC-20A)检测。色谱条件：色谱柱为Bio-Rad Aminex HPX-87H 有机酸分析柱；流动相为 5 mmol/L稀硫酸；流速0.6 mL/min；柱温30 ℃； 进样体积5 μL，检测波长210 nm。其中苯丙酮酸钠和D-苯基乳酸用紫外检测器检测，葡萄糖用RID-10A示差检测器检测。

2　结果与讨论

2.1目的基因的表达与功能验证

用于本研究的Lactobacillusplantarum(CGMCC:1.2437)乳酸脱氢酶基因(D-ldh)编码 332 个氨基酸，第52位酪氨酸经过定点突变成亮氨酸。大肠杆菌原始菌和空载体对照E.coliBL21(DE3)/pET28a(+)、重组菌E.coliBL21(DE3)/pET28a-D-ldh、突变重组菌E.coliBL21(DE3)/ pET-28a-D-ldhY52L经1 mmol/L IPTG，25 ℃诱导表达4 h收集菌体，用于全细胞转化。取一部分菌体进行SDS-PAGE分析。该重组菌在近41 ku处有明显蛋白条带(图2,泳道3)，相对分子质量和预期的大小一致,表明乳酸脱氢酶在大肠杆菌中表达成功。酶活测定结果表明(表1)野生型重组乳酸脱氢酶的比酶活力为6.7U/mg，将乳酸脱氢酶52位的酪氨酸突变成亮氨酸后，乳酸脱氢酶对苯丙酮酸催化活力有显著提高，较野生型乳酸脱氢酶提高了9.4倍，比酶活力达到63.1 U/mg。突变株对丙酮酸的催化活力大幅下降。这些结果与日本学者 ISHIKURA 等[15]和TOKUDA等[16]的研究结果一致。空白大肠杆菌和空载体对照E.coliBL21(DE3)/pET28a(+)检测不到乳酸脱氢酶活力，与袁剑等[17]的研究结果一致。

突变重组大肠杆菌和对照菌全细胞转化结果见图3。定点突变重组菌的产量达到5.34 g/L，比未突变重组菌D-苯基乳酸的产量(3.66 g/L)增加了46%。说明将乳酸脱氢酶底物结合位点处的亲水性的酪氨酸替换成疏水性的亮氨酸，明显增强了乳酸脱氢酶对底物苯丙酮酸的催化活力，使其具有了更强的催化效率。但突变菌株全细胞转化底物能力的提升

有限，与突变型乳酸脱氢酶粗酶对苯丙酮酸的酶活测定结果有差异。这是因为体外酶活力测定体系含有足够多的辅因子提供还原力，氧化还原反应能持续进行。突变菌株全细胞转化苯丙酮酸生成苯基乳酸的反应会因为胞内辅因子的不足而中断[18]。另一方面，胞内转化反应还与胞内底物和产物的量有关，胞内转化反应速率会受到底物运输的效率影响。 转化产物苯基乳酸具有广谱抑菌作用，产物累积超过菌体耐受浓度时会破坏菌体的新陈代谢，抑制酶的活性[4]。

大肠杆菌原始菌BL21(DE3)和含有pET-28a空质粒的大肠杆菌亦有一定的能力催化生成D-苯基乳酸，产量分别为0.98 g/L和0.77 g/L，可能大肠杆菌胞内也有少量能转化苯丙酮酸生成D-苯基乳酸的氧化还原酶。

图1　质粒pET-28a-D-ldh 双酶切验证图Fig.1　The verification of the plasmid pET-28a-D-ldhY52L

M-标准蛋白Marker;1-原始菌株；2-空质粒菌株；3-经诱导的重组菌图2　重组质粒pET-28a-D-ldhY52L在BL21(DE3)中的诱导表达Fig.2　The analysis of D-lactate dehaydrogenase protein by SDS-PAGE

底物比酶活/(U·mg-1)E.coliBL21(DE3)E.colipET-28aE.colipET-28a-ldhE.colipET-28a-ldhY52L丙酮酸(pyruvate)NDND17.2±0.398.3±0.12苯丙酮酸(phenylpyruvicacid,PPA)NDND6.7±0.1963.1±1.32

ND: not detected.

图3　不同菌株产D-苯基乳酸产量的比较Fig.3　The bioconversion effect of native strains and recombinant strains

2.2突变菌株转化生成D-苯基乳酸条件的优化

2.2.1诱导温度对突变重组菌转化合成D-苯基乳酸的影响

由图4A可看出，诱导温度对D-苯基乳酸的产量有着较大的影响，当诱导温度为25 ℃时，D-苯基乳酸的产量比诱导温度为20 ℃时和35 ℃的产量分别高出3.5%和58.63%。由此可见，25 ℃为D-苯基乳酸生产的最适温度，过低或者过高的温度都不利于D-苯基乳酸的转化生成。

2.2.2诱导剂浓度对突变重组菌转化合成D-苯基乳酸的影响

当IPTG浓度达到0.2 mmol/L时，D-苯基乳酸的

产量达到6.04g/L(图4B)，比原始诱导条件0.6 mmol/L高出13%。而当诱导剂浓度逐渐加大时，D-苯基乳酸的产量呈下降趋势。我们同时测定了不同浓度诱导剂下的菌体密度，浓度过高的诱导剂对菌体生长起抑制作用。

2.2.3诱导时间对突变重组菌合成D-苯基乳酸的影响

诱导时间对D-苯基乳酸合成的影响如图4C所示，不超过6 h的情况下，随着诱导时间的增加，D-苯基乳酸的产量显著提高，在6 h时候达到最大值，原因是大肠杆菌的菌体浓度随时间增加呈逐渐上升趋势。然而诱导时间增加到 8 h的时候，D-苯基乳酸的产量急剧下降，可能是全细胞转化活性降低。转化时间为10 h的时候，D-苯基乳酸的产量有了稍微的上升，应该与菌体量达到新积累有关。

2.2.4pH对D-苯基乳酸产量的影响

由于大肠杆菌的最适生长pH在6.0～8.0，所以本研究选取pH值6.0～8.0作为研究范围(图4D)，如图所示，转化培养基的pH对D-苯基乳酸的转化生成反应影响不是很显著，但pH为8.0时，D-苯基乳酸的产量明显降低。pH值为6.5～7.5时有利于大肠杆菌的生长和D-苯基乳酸的积累。

图4　不同诱导条件对D-苯基乳酸产量的影响Fig.4　Effect of different induction condition on the production of D-PLA

2.3底物流加强化D-苯基乳酸合成

由于底物的积累对D-苯基乳酸的合成有抑制作用，所以本研究考察了分批添加底物对D-苯基乳酸的产量以及转化率的影响。在加入苯丙酮酸开始转化反应的1 h内，苯丙酮酸快速转化成D-苯基乳酸(图5)，1～6 h内D-苯基乳酸产量依然逐渐上升，6 h以后菌体转化活力下降，D-苯基乳酸产量呈下降趋势。反应全过程共加入苯丙酮酸28 g。经6 h全细胞转化，D-苯基乳酸产量达到最大值，为18.47 g/L,转化率为65.96%，生产率3.07 g/(L·g·h)。相比ZHENG等[11]报道用凝结芽孢杆菌(BacilluscoagulansSDM)全细胞生产D-苯基乳酸[产量 37.2 g/L，转化率70%，生产率2.3 g/(L·h)]，本研究生产率提升了33.5%，但D-苯基乳酸产量和转化率仍需进步一提高。赵明月等[14]报道的将D-乳酸脱氢酶和甲酸脱氢酶在大肠杆菌中共表达，利用甲酸脱氢酶来提高胞内辅因子水平，进一步提高生物催化能力，经分批补加苯丙酮酸，D-苯基乳酸产量累积达18.92 g/L，略高于本研究D-苯基乳酸总产量，说明在D-乳酸脱氢酶催化合成D-苯基乳酸的过程中，辅因子的再生对生物转化作用显著。

图5　最适条件下分批补料添加苯丙酮酸钠生产D-苯基乳酸时间曲线Fig.5　Time course of production of PLA from PPA by fed-batch under the optimum conditions

3　总结

D-乳酸脱氢酶是转化苯丙酮酸生成D-苯基乳酸的关键酶，本研究将Lactobacilluspentosus的D-ldh 克隆到大肠杆菌中过表达。根据日本学者Ishikura等[15]和Tokuda等[16]的研究表明，将来自戊糖乳酸菌(Lactobacilluspentosus)D-乳酸脱氢酶催化位点第52位上的酪氨酸突变成亮氨酸后，该重组酶对苯丙酮酸的亲和力上升了20倍，酶的催化效率提高了232倍。本研究利用PCR基因定点突变技术将D-乳酸脱氢酶第52位酪氨酸突变成亮氨酸。将D-苯基乳酸的产量提升到5.34 g/L，比未突变重组菌D-苯基乳酸的产量(3.66 g/L)增加了46%。我们进一步对突变菌株诱导条件进行优化，在最优的转化条件下，对突变重组菌进行了底物流加培养，经6 h全细胞转化，D-苯基乳酸产量达到最大值，为18.47 g/L，转化率为65.96%。综上，本研究构建的突变重组大肠杆菌用于合成D-苯基乳酸，极大提高了D-苯基乳酸的产量和产率。而且大肠杆菌用于外源基因表达，具有遗传背景清晰，生长周期短，培养条件简单等优点，适用于工业化大规模生产[19-20]。但是由于重组质粒的不稳定性，重组菌在培养过程中可能会存在质粒发生突变或丢失的情况, 使重组菌失去了原有的表型特征[21-22]。所以，为了进一步提高大肠杆菌的生产效率和菌株的遗传稳定性，可以将经过定点突变，能高效表达乳酸脱氢酶的基因整合到大肠杆菌基因组里。

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The recombinant expression ofD-lactic dehydrogenase mutantD-LDHY52L inE.coliand its application inD-phenyllactic acid synthesis research

JIANG Zhuo-yue1, JI Wei2, QIAN Bei-bei2, ZHU Yi-bo2*,QI Bin2

1 (School of Biology and Basic Medical Sciences, Soochow University, Suzhou 215123, China) 2 (Research Center of Fermentation Engineering, Key Laboratory of Food and Biotechnology, Changshu Institute of Technology, Changshu 215500, China)

The three-dimensional structures ofD-lactic dehydrogenase fromLactobacilluspentosusimply that the side chain of 52 Tyr ofD-LDH can be located very near the C3 substituent group of 2-ketoacid substrate, thereby, associated with the recognition of substrate side chain. In this study, The replacement of hydrophilic Tyr 52 with hydrophobic Leu was done by the site-directed mutagenesis. The single amino acid replacement of Tyr52 with Leu significantly increased the affinity and activity toward phenylpyruvic acid. The mutantD-LDHY52L was over-expressed inEschrichiacoliBL21 (DE3). The whole cell transformation of PPA intoD-PLA was researched in this study .The results showed that production ofD-PLA was increased 46% by the mutant enzyme, compared to the native enzyme. The highest production ofD-PLA was 18.47g/L in the fed-batch transformation, and the conversion ratio was 65.96%.

D-lactic dehydrogenase; site-directed mutagenesis; recombinant expression; phenylpyruvic acid;D-phenyllactic acid

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201601001

硕士研究生(朱益波教授为通讯作者,E-mail：centuryrain@126.com)。

国家自然科学基金面上项目(31470092)；江苏省自然科学青年基金项目(BK20130380)；江苏省高校自然科学研究面上项目(13KJB550002)；江苏省“六大高峰人才”资助计划项目(NY-021)；苏州市科技支撑计划(SNG201354)；常熟市科技计划项目(CN201412)

2015-06-02，改回日期：2015-08-31