丹参酮ⅡA通过调控PKC/CyclinD1通路抗大鼠心肌成纤维细胞增殖作用研究

付晓杰，孙红霞

(1.北华大学校医院，吉林 吉林　132013；2.北华大学药学院，吉林 吉林　132013)



丹参酮ⅡA通过调控PKC/CyclinD1通路抗大鼠心肌成纤维细胞增殖作用研究

付晓杰1，孙红霞2

(1.北华大学校医院，吉林 吉林132013；2.北华大学药学院，吉林 吉林132013)

目的观察丹参酮ⅡA(TaishinoneⅡA，TSN)和蛋白激酶C(PKC)抑制剂白屈菜红碱(Chelerythrine，Chele)抗血管紧张素Ⅱ(Angiotensin Ⅱ，AngⅡ)诱发的心成纤维细胞(Cardiac fibroblast，CFb)增殖、细胞周期、Ⅰ型胶原纤维(Collagen Ⅰ)、PKC和细胞周期蛋白CyclinD1表达的影响，阐明TSN抗CFb增殖的分子机制.方法培养的新生Wistar大鼠CFb分为对照组、AngⅡ组、Chele+AngⅡ组、Chele+AngⅡ+TSN组和AngⅡ+TSN组，胰酶消化、差速贴壁培养CFb，噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞增殖；免疫细胞化学染色(IC)法测定Collagen I含量；流式细胞仪(FCM)检测细胞周期；免疫印迹法(WB)检测PKC和细胞周期蛋白CyclinD1表达.结果 与AngⅡ组比较，Chele和TSN组及Chele+AngⅡ+TSN组能显著降低CFb增殖率(P<0.05或P<0.001),降低Collagen Ⅰ含量(P<0.05或P<0.01),提高CFb G0/G1期细胞百分比,降低S期细胞百分比(P<0.05或P<0.01),抑制PKC和CyclinD1蛋白表达(P<0.05或P<0.01).结论 TSN和Chele能显著抑制由AngⅡ诱导的CFb增殖和胶原蛋白分泌，其机制可能是通过抑制PKC-CyclinD1传导通路实现的.

丹参酮ⅡA；白屈菜红碱；CyclinD1；心肌成纤维细胞

【引用格式】付晓杰，孙红霞.丹参酮ⅡA通过调控PKC/CyclinD1通路抗大鼠心肌成纤维细胞增殖作用研究[J].北华大学学报(自然科学版)，2016，17(5)：616-619.

心肌纤维化(MF)以心成纤维细胞增殖、胶原大量沉积和分布为特征，可导致心室重构.AngⅡ通过CFb上Ⅰ型受体，诱导CFb增殖并分泌大量胶原纤维，导致MF发生[1].研究表明：丹参酮ⅡA(TSN)是常用的活血化瘀中药丹参提取物，能抑制CFb增殖和减少胶原合成[2]，但对其抑制增殖机制的信号通路研究报道甚少.因此，本实验观察TSN对AngⅡ诱导成纤维增殖、细胞周期变化、 Ⅰ型胶原含量、PKC和细胞周期蛋白D1表达及PKC抑制剂对各指标影响，为其抗MF作用信号通路作用的研究提供依据.

1　材料与方法

1.1细胞、试剂、仪器

1～3 d出生乳鼠心肌细胞，放置含10% 胎牛血清IMDM培养液，在37 ℃、5% CO2、饱和湿度条件下培养60～90 min.差速贴壁法分离CFb，经倒置显微镜、TE、IC检测FN阳性染色及α-SMC阴性染色，CFb纯度98%，近融合生长时按1∶6传代，实验采用3代细胞.TSN(中国药品所，编号115767-201416)；白屈菜红碱、胰蛋白酶(宝泰克公司)；S-P免疫组化试剂盒(福州迈新)；PKC，CyclinD1，AngⅡ，MTT(西格玛公司)；IMDM培养基(HyClone 公司)；胎牛血清(杭州四季青)；CO2培养箱(三瑞斯公司)；自动酶标检测仪(AUSTRALIA)；奥林巴斯倒置显微镜(日本).

1.2实验分组

Con组：IMDM空白培养液；AngⅡ组：培养基加入终浓度10-7mol/L AngⅡ；Chele+AngⅡ组：培养基加入终浓度为10-7mol/L AngⅡ和10-6mol/L Chele；Chele+AngⅡ+ TSN组：培养基加入10-7mol/L AngⅡ，10-6mol/L Chele，10-6mol/L TSN；TSN组：培养基加入10-6mol/L TSN，10-7mol/L AngⅡ.

1.3MTT检测细胞增殖能力

每组7复孔，将各组细胞接种于培养板中，药物作用24 h，每孔加入5 g/L MTT 10 μL，有蓝紫色结晶沉淀后加入DMSO 150 μL降解沉淀，酶标仪490 nm波长处测定光吸收值(A值)，经IMDM不含细胞的空白孔调零.各干预组与AngⅡ组A值差值百分率表示CFb增殖抑制率.

1.4FCM方法检测细胞周期

各干预因素作用24 h后收集细胞，70%、-20 ℃乙醇过夜，重悬于PBS中，将RNA酶加入细胞悬液中，37 ℃水浴30 min，加入PI染液，冰浴30 min.用尼龙网过滤，上机.根据PI标记的DNA含量确定细胞所处细胞周期，并计算各时相分布百分比(%).

1.5免疫组化法检测Collagen I纤维表达

用预先放置7 mm×7 mm盖玻片的24孔培养板培养CFb，药物干预24 h，取出盖玻片用PBS洗涤，经Poly-甲醛固定，SP法IC染色，一抗用PBS作阴性对照.阳性细胞为胞质棕黄色颗粒，Image-ProPlus 分析系统行图像分析，对表达于胞质的棕黄色颗粒定位.计算每组切片视野阳性点面积总和、光密度值，确定细胞中Ⅰ型胶原平均阳性强度百分比(%).

1.6WB检测PKC和细胞CyclinD1蛋白表达

药物干预12 h收集细胞，SDS-PAGE分离蛋白，100 V、20 mA电转移2 h，PVDF 膜蛋白转移，BSA封闭，加稀释的小鼠抗大鼠CyclinD1抗体，4 ℃孵育过夜，HRP标记IgG抗体室温孵育2 h，洗膜，DAB显色.凝胶成像系统分析PKC和CyclinD1灰度值，与β-actin比值表示蛋白质含量.

1.7统计学分析

2　结　　果

2.1MTT法检测TSN对CFb增殖抑制作用

AngⅡ组MTT的代谢率提高，MTT-OD值明显升高，与Con组比较具有显著性统计学意义(P<0.001)，可见AngⅡ对CFb具有促增殖作用.加入各干预因素后，MTT值显著低于AngⅡ组，具有显著性统计学意义(P<0.05或P<0.01).结果见表1.

2.2FCM检测细胞周期

CFb S期的细胞百分率在AngⅡ组显著高于Con组，G0/G1期细胞百分率显著低于Con组(P<0.01).各不同处理因素作用后，CFb S期的细胞百分率显著下降，而G0/G1期细胞百分率显著升高(P<0.05或P<0.01).结果见表2.

表1白屈菜红碱和丹参酮ⅡA对CFb增殖的抑制作用

注：与对照组比较，#：P<0.001，P<0.05；与Ang Ⅱ组比较，**：P<0.01 ；△：P<0.05

表2白屈菜红碱和丹参酮ⅡA对细胞周期的影响

注：与对照组比较，#：P<0.05，##：P<0.01；与 AngⅡ组比较，*：P<0.05，**：P<0.01；与AngⅡ+Chele组比较，△：P<0.05

2.3IC检测Ⅰ型胶原纤维表达

与对照组相比，AngⅡ组棕黄色染色细胞增多，显示Collagen Ⅰ表达量明显提高(P<0.01)；与AngⅡ相比，Chele+AngⅡ组和AngⅡ+TSN组降低Collagen Ⅰ表达(P<0.01)，AngⅡ+Chele+TSN组最为明显(P<0.001)，与AngⅡ+Chele group 比较，差异显著(P<0.01).见图1，表3.

2.4WB检测PKC和CyclinD1蛋白表达

AngⅡ组PKC，CyclinD1蛋白表达与Con组比较明显升高(P<0.01).与AngⅡ组比较，Chele组、TSN组具有明显的抑制PKC和CyclinD1蛋白表达作用(均P<0.05)，AngⅡ+Chele+TSN共用组抑制作用最强(P<0.01)，与Chele组比较差异具有显著性统计学意义(P<0.05).见图2，表4.

注：与对照组比较，#：P<0.01；与 AngⅡ组比较，*：P<0.05，**：P<0.01；与AngⅡ+chele组比较，△：P<0.05

3　讨　　论

心肌纤维化(MF)以CFb增殖并大量分泌胶原蛋白为显著特征，后期发展为心室重构.AngⅡ与CFb上AT1型受体结合，通过G蛋白激活磷脂酶C(PLC)，PLA2和PLD.PLC催化PIP2产生二酰基甘油(DAG)和三磷酸肌醇(IP3)，IP3通过促进Ca2+释放进而间接激活PKC，DAG可直接活化PKC，促进CFb增殖.研究显示：多种信号通路参与了MF发生和发展[3-4]，活化后的PKC在经核蛋白磷酸化后与转录因子C-Myc，NF-κB，C-Fos和C-Jun结合，启动基因转录和蛋白翻译过程，诱导MF发生[4-5].

在G1期调节中，CyclinD1是一种重要的调控蛋白，还属于及早表达蛋白，与细胞周期蛋白依赖激酶(CDK)形成复合物，经由CDK激酶作用后磷酸化，增进一些关键基因表达.CyclinD1是Cyclin D家族成员，编码蛋白与CDK2，CDK4，CDK5，CDK6 等激酶结合，活化CDK，使细胞由G1期进入S期[5].细胞增殖主要取决于细胞内CDK活性，其活性依赖于正调控因子细胞周期蛋白及负调控因子CDI 的浓度，形成以视网膜细胞瘤蛋白(pRb)为关键的复杂调控系统.磷酸化的Rb蛋白构象改变释放结合的核转录因子E2F和具有激酶活性的C-Abl蛋白等，游离的E2F进入核内，结合一系列与S 期相关基因启动子区域，促进基因转录，基因产物促进细胞通过细胞周期的限制点进入自主分裂程序[6].

TSN是丹参根的干燥提取物，众所周知丹参具有活血化瘀作用.诸多研究证实：TSN ⅡA在抗MF作用中较为肯定，TSN ⅡA具有抗心肌肥厚及抗血小板聚集等作用[7].实验数据表明：Chele+TSN明显降低MTT值(P<0.05或P<0.01)，减少Ⅰ型胶原含量(P<0.01或P<0.001)，明显增多G0/G1期细胞百分比，减少S期细胞百分比(P<0.05或P<0.01)，减少PKC，CyclinD1蛋白表达(P<0.05或P<0.01)，与Chele+AngⅡ相比，有显著差异(P<0.05或P<0.01)，显示TSN与Chele可协同作用抑制PKC和CyclinD1蛋白表达，从而抑制CFb增殖和胶原生成.PKC活性受到抑制后，AngⅡ诱导的CFb增殖受阻.Chele+AngⅡ组和TSN+AngⅡ组比较上述各指标无显著差异(P>0.05)，TSN组与AngⅡ组相比数值虽有下降，但未降到正常水平，说明TSN不能完全阻断PKC通路，尚有其他通路参与PKC介导的AngⅡ促CFb增殖作用[8-10].文献报道：CyclinD1属早期调节蛋白，故选取12 h作为干预因素时间点[11].PKC抑制剂能明显抑制CFb增殖和Ⅰ型胶原分泌，降低CyclinD1蛋白表达，抑制细胞增殖，说明AngⅡ诱导MF是通过激活PKC信号通路得以实现.

综上所述，AngⅡ通过PKC通路活化来增加CFb增殖和胶原分泌，导致MF，TSN通过部分阻断PKC通路对抗AngⅡ的诱导作用，减少细胞周期CyclinD1蛋白表达，抑制细胞增殖，使细胞停滞于G0期，从而阻止CFb增殖和胶原蛋白合成与分泌，抑制MF的发生.

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【责任编辑：陈丽华】

Inhibition of Taishinone ⅡA on Cardiac Fibroblasts Proliferation through PKC/CyclinD1Pathways in Rats

Fu Xiaojie1，Sun Hongxia2

(1.Hospital of Beihua University，Jilin 132013，China；2.PharmacyCollegeofBeihuaUniversity，Jilin132013，China)

Taishinone(TSN)ⅡA；Chelerythrine(Chele)；cyclinD1；cardiac fibroblast

1009-4822(2016)05-0616-04

10.11713/j.issn.1009-4822.2016.05.012

2016-03-12

吉林省科技发展计划项目(200705355).

付晓杰(1966-)，女，主管检验师，主要从事检验学临床研究，E-mail：752261452@qq.com；通信作者：孙红霞(1965-)，女，博士，教授，硕士生导师，主要从事心血管药理学研究，E-mail：sunhongxia@126.com.

R542.2

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