GnRH、SS及其受体表达与急性末端回肠炎相关性的实验研究

周国华，肖 蕊

（湖南师范大学医学院附属湘南医院 / 解放军第169医院，衡阳 421002）

GnRH、SS及其受体表达与急性末端回肠炎相关性的实验研究

周国华，肖 蕊

（湖南师范大学医学院附属湘南医院 / 解放军第169医院，衡阳 421002）

目的： 探讨GnRH、SS及其受体在实验性急性末端回肠炎中的表达的变化及其意义。方法： 选用健康成年雄性杂种犬40只，随机分成8组，每组5只，将后四组分别给予手枪弹颅脑火器伤造模，观察其GnRH、SS及其受体的变化。结果： 术后各组实验犬血浆中GnRH、SS浓度的变化，在0.5h时各组实验犬血浆中GnRH、SS浓度明显下降，以后随时间延长GnRH、SS浓度呈现递增趋势；术后末端回肠组织GnRH受体、SS受体的表达变化，GnRHR、SSTR表达亦呈现先降低后增多的趋势，且GnRH、SS受体与对应GnRH、SS浓度呈现较好的一致性。结论： 急性末端回肠炎血浆中GnRH、SS浓度升高及其受体的表达增多，GnRH、SS及其受体参与了急性末端回肠炎的调控。

急性末端回肠炎；应激；促性腺激素释放激素；生长抑素；受体

急性末端回肠炎（Acute ter minal ileitis，ATI）是指由各种原因所导致的末端回肠黏膜、黏膜下层发生急性、浅表性、非特异性的炎症。近年来随着内镜技术和设备的进步，其发现ATI有显著增多之势，虽然动物的ATI病因可能主要与感染有关，但人体ATI的病因和发病机制仍不十分清楚［1］。应激是否引起ATI？促性腺激素释放激素（GnRH）、生长抑素（SS）及其受体在实验性急性末端回肠炎中的有无变化均未见报道。本研究建立了高温高湿高血糖环境下颅脑火器伤实验犬模型，观察GnRH、SS浓度及其受体的变化，探讨应激下GnRH、SS与ATI关系及其调控机制。

1 资料与方法

1.1 实验分组 选用健康成年雄性杂种犬40只，体重14±1kg，随机分成8组，每组实验犬5只，常温常湿正常血糖组（A组）、高温高湿高血糖组（B组）、高温高湿正常血糖组（H组）、常温常湿高血糖组（G组）、常温常湿正常血糖颅脑火器伤组（C组）、常温常湿高血糖颅脑火器伤组（D组）、高温高湿正常血糖颅脑火器伤组（E组）、高温高湿高血糖颅脑火器伤组（F组），将C，D，E，F组予以颅脑枪弹火器伤造模。

1.2 实验犬建模 通过设置环境条件和热适应组动物的准备后，实验前用舒眠宁0.5 1.0 mL对实验犬行臀大肌麻醉，待实验犬失去反抗力后，尽快由股静脉推注50%葡萄糖溶液，造成高血糖实验模型。将实验犬置于提前备好的沙坑内，用手枪瞄准实验犬额部眶上突旁，制作颅脑火器伤模型。

1.3 伤后处置 伤后立即将在无菌条件下立即行腹部手术，剖腹寻找回盲部，并切取回肠末端组织后将残端吻合，术后关腹消毒。根据设定的时间点采集各实验犬的外周血，时间点分别设为： 0 h、0.5 h、1.0h、1.5h、2h。

1.4 ELISA法检测实验犬血浆中GnRH、SS的浓度

1.5 Western blot 检测A，B，F组实验犬GnRH受体和SS受体的表达

1.6 统计学方法 将获得的实验数据应用SPSS18.0统计软件包进行统计分析。实验中连续变量用均数±标准差表示，数据结果均运用完全随机设计成组资料的方差分析（One-Way ANOVA）进行统计分析，运用Levene法方差齐性检验，如果各组方差齐时则用S-N-K法进行均数间的两两比较；如果方差不齐时则用Dunnett's C 法进行均数间的两两比较。实验组内多个时间点统计分析采用重复测量的方差分析；组间比较采用单因素方差分析和各组均数t检验处理，设检验水准α=0.05，则P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血浆中GnRH浓度变化 按时间点采集各实验犬的外周血并作相应的处理，利用ELISA法检测各样品中GnRH的浓度，结果见表1。结果显示，各组实验犬血浆中GnRH的浓度变化均符合0h＞0.5h；0.5h＜1h＜1.5 ＜2h。各实验组犬在0.5h时血浆中GnRH的浓度明显下降，以后随着急性应激时间的延长，血浆中GnRH的浓度呈现上升趋势，且在1.5h后均高于0h，说明急性应激后实验犬血浆中GnRH的浓度呈现先降低后上升之趋势。不同时间点各组实验犬血浆中GnRH浓度的比较，将各组实验犬血浆中GnRH浓度按5个不同时间点的分别进行比较，总体趋势为F＞D＞B＞G＞A＞H＞E＞C（P＜0.05）。

表1 各组实验犬术后不同时间点外周血中GnRH浓度的变化情况

2.2 血浆中SS浓度变化 根据实验方法中的详细描述按时间点采集各实验犬的外周血并作相应处理；利用ELISA法检测各样品中SS的浓度。将所得数据用统计学方法整理，统计结果见表3。结果显示，各组实验犬血浆中SS的浓度均符合0h＞0.5h；0.5h＜1.0h＜1.5h ＜2h。各实验组犬在0.5h时血浆中SS的浓度明显下降，以后随着应激后时间的延长，血浆中SS的浓度呈现上升趋势，且在1.5h后均高于0h。说明应激后各组实验犬血浆中SS的浓度总体呈现先降低后上升趋势。 不同时间点各组实验犬血浆中SS浓度的比较，将不同时间点各组实验犬血浆中SS浓度进行比较，总体趋势为F ＞D＞E＞C＞A＞B＞H＞G（P＜0.05）。

表2 不同环境不同时段SS的变化情况

2.3 GnRH受体及SS受体的表达 从8个实验组中选取A组、B组及F组，用Western blot检测其GnRH受体及SS受体的表达。检测结果如图1所示： 内参GAPDH均有较明显的高表达，且个样品之间均一性较好；目的蛋白GnRHR与SS R2条带特异，清晰可辨。用灰度分析各条带的累积光密度参考值（IOD），分别计算GnRHR及SS R2与内参GAPDH的相对表达量。

图1 A，B，F组GnRHR与SS R2 Western blot 检测结果

2.4 GnRHR相对表达比较 将Western blot检测A，B，F三组实验犬回肠末端组织中GnRHR相对表达的结果进行比较，见表3。各组实验犬回肠末端组织中GnRHR的相对表达量均符合0h＞0.5h（P＜0.05）；0.5h ＜1h＜1.5h＜2h（P＜0.05）；各实验组犬在0.5h时回肠末端组织中GnRHR的相对表达量明显下降；而后随着应激时间的延长，回肠末端组织中GnRHR的相对表达量呈现上升，且在1.5h后均高于0h。说明GnRHR表达量呈现先降低后上升趋势与GnRH浓度的增加基本一致。不同时间点GnRHR相对表达比较，0h和0.5h时B ＞A＞F（P＜0.05）；1h时B＞F＞A（P＜0.05）；1.5h和2h时无明显差异（P＞0.05）。

表3 目的蛋白灰度分析结果及相对表达量结果

2.5 SS R2相对表达比较 将Western blot检测A，B，F三组实验犬回肠末端组织中SSR2相对表达的结果进行比较，各组实验犬回肠末端组织中SSR2的相对表达量均符0.5h＜1h＜1.5h＜2h（P＜0.05）；实验犬随着应激时间的延长，回肠末端组织中SSR2的相对表达量呈现上升趋势。SSR2表达量的上升趋势与SS浓度的增加基本一致。 不同时间点SS R2相对表达比较，0h和0.5h时无明显差异（P＞0.05）；1h到2h时F＞B＞A（P＜0.05）。

3 讨论

应激与胃肠病发病有密切联系，神经内分泌免疫调节网络在胃肠道疾病发生、发展方面的作用和地位越来越受重视［1，2］。应激首先刺激促进胃肠运动与分泌的胃肠激素分泌，继而反馈刺激抑制胃肠运动与分泌的胃肠激素分泌，当各种胃肠激素水平失衡，造成功能性消化不良、肠激惹综合征、消化性溃疡等疾病［3］。有实验通过观察光照应激状态下SD大鼠小肠黏膜GnRH受体的分布和表达变化，得出GnRH受体随着光照应激时间的延长，在大鼠小肠中表达量发生改变［4］。另有实验证实，胃泌素、生长抑素与颅脑损伤后应激性上消化道出血有关［3］。促性腺激素释放激素（GnRH）和生长抑素（SS）均为肽类激素，GnRH、SS及其受体在消化道内广泛存在，有着广泛的生理功能［6，7］，但它们在应急状况下与ATI的发病及其关系未见报道。

近几年，末端回肠炎的发病呈现增多的趋势，已有实验通过观察肠上皮间淋巴细胞与慢性末端回肠炎的关系，得出肠上皮间淋巴细胞可能在慢性末端回肠炎发病及致病过程中发挥重要作用［8］；同时，集合淋巴结（PP结）及其淋巴细胞在末端回肠炎发病过程中起着不可忽视的作用，表现为持续的免疫反应［9］；另有研究证实，通过酪酸梭菌活菌胶囊联合应用甲硝唑治疗慢性末端回肠炎有良好的疗效［10］。这些均提示，末端回肠炎与感染、免疫反应有关，但对它与其激素及其受体的变化及影响的研究甚少。

本研究显示，各组实验犬血浆中GnRH、SS浓度发生改变： 在0.5h时各组实验犬血浆中GnRH、SS浓度明显下降，以后随时间延长GnRH、SS浓度呈现递增，呈现先降低后上升之趋势；末端回肠组织GnRH受体、SS受体的表达亦发生变化，GnRHR、SSTR表达亦呈现先降低后增加的趋势；且GnRH受体、SS受体与对应GnRH浓度、SS浓度呈现时间及升降有较好的一致性。

本研究还显示，术后各组实验犬血浆中GnRH、SS浓度及其受体均呈现先降低后升高的趋势，且与应激的程度或损伤程度相关，GnRH总体趋势为F＞D＞B ＞G＞A＞H＞E＞C、SS总体趋势为F＞D＞E＞C＞A＞B＞H＞G，虽然稍有差异，但F和D组基本一致。同时说明GnRH浓度的升高与急性末端回肠炎有关，而GnRH受体的表达趋势与血浆中GnRH浓度的变化呈现出一致性。GnRH浓度的持续升高可能导致消化道紊乱的重要原因，这可能揭示了急性末端回肠炎通过改变GnRH等激素的水平而引起肠道功能紊乱，特别是影响回盲部功能紊乱，导致结肠回肠反流，进而导致ATI的发生和发展。

SS受体局限分布于肠肌层、黏膜下层分泌抑胃肽的小肠K细胞分布的环形肌层以及血管系统和淋巴滤泡中，对肠道的生物功能学作用主要是抑制作用，SS浓度的升高有利于肠道系统的保护，很可能是肠道功能紊乱或遭受刺激后，机体启动的应激保护措施。有实验证明SS可通过旁分泌机制由突起释放到G细胞和壁细胞膜上，可抑制HCI和胃泌素分泌，通过血液循环对消化道起作用。SS对肠道的生物功能学作用主要是抑制胃、肠和胆囊的蠕动，抑制黏膜细胞的增生，减少胃肠道壁血流量，抑制肝胆汁和小肠液的分泌，抑制胃泌素等各种胃肠激素的分泌，减少小肠对水、电解质、葡萄糖、氨基酸和三酰甘油的吸收［5］。本研究显示，血浆和末端回肠组织中SS及其受体先降低后升高的趋势，与GnRH是一致的。SS的持续升高可能导致消化道紊乱的另一原因，这可能揭示了应急后改变了SS而引起肠道功能紊乱，特别是影响回盲部功能紊乱，结肠回肠反流后小肠的清除功能有所下降，进而导致ATI的发生和发展。我们认为，GnRH和SS在相同的时间或相同的部位的持续升高及其受体的高表达有可能进一步加重了ATI的发生和发展。

本研究有明显不足，主要表现在，用Western blot检测其GnRH受体及SS受体的表达时只取三组（A、B、F组）没有对各组GnRH受体及SS受体的表达全部进行研究。尽管如此，仍不难得出如下结论，急性应激状态可导致末端回肠炎的发生和发展，与GnRH、SS浓度及其受体的变化有关，且与应激和损伤的程度有关。我们认为，可否通过缩短应激的时间、或者增加SS的浓度来对胃肠道进行保护，增加外源性SS可能促进急性末端回肠炎的愈合，为ATI的防治提供了理论依据。

［1］ 周国华， 主编. 末端回肠炎的基础与临床［M］. 北京： 人民军医出版社， 2008. 52-53.

［2］ Lee JC， Cho YJ， Kim J， et al. Region-specific changes in the immunoreactivity of vasoactive intestinal peptide and pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide receptors （VPAC2， and PAC1 receptor）in the aged rat brains［J］. Brain Res， 2010， 1351（1）： 32-40， 688.

［3］ 虞重坚， 江绍基， 萧树东. 胃肠道激素［J］. 上海第二医科大学学报，2009（13）： 109-113.

［4］ 时姗姗， 陶晓倩， 韩雪峰. 光照应激对SD大鼠小肠促性腺激素释放激素受体表达的影响［J］. 医学研究生学报， 2009， 22（11）： 1127-1130.

［5］ 曹碧波， 谈超， 丁明亮. 生长抑素和胃泌素检测在合并上消化道出血颅脑损伤中的意义［J］. 中国实用神经疾病杂志， 2012， 15（9）： 1673-5110.

［6］ 刘晓霞， 宗珊， 李真， 等. GnRH在宫颈鳞状细胞癌中的表达及意义［J］. 中国免疫学杂志， 2012， 28（5）： 427-427.

［7］ Schubert mL. Gastric exocrine and endocrine secretion［ J］. Curr Opin Gastroenterol， 2009， 25（6）： 529-536.

［8］ 周国华， 胡 咏， 陈叶青， 等. 肠上皮间淋巴细胞与慢性末端回肠炎的相关性分析［J］. 华南国防医学杂志， 2010， 24（3）： 205-207.

［9］ 王为， 周国华， 冷明芳， 等. 集合淋巴结淋巴细胞在实验性末端回肠炎发病中的变化及其意义［J］. 临床消化病杂志， 2010， 22（3）： 154-156.

［10］ 郭琳. 酪酸梭菌活菌胶囊联合甲硝唑治疗慢性末端回肠炎［J］. 陕西医学杂志， 2014， 43（1）： 73-75.

GnRH， SS， its receptor expression and acute ter minal ileitis correlation of experimental research

Zhou Guo-hua， Xiao Rui
（Department of Gastroenterology， Xiangnan Affiliated Hospital of Hunan Normal University， The 169th Hospital of PLA， Hengyang 421002， China）

Objective To investigate the gonadotropin releasing hormone （GnRH）， somatostatin （SS） and its receptor expression in experimental acute ter minal ileitis change and its significance. Methods Choosing healthy adult male dogs only 40 then rando mLy divided into 8 groups and each group is made of 5dogs， only after the four groups were given hand bullets craniocerebral firearm injury model then observe the changes of the GnRH， SS and their receptors. Results The change of concentration of GnRH and SS indog plasma of the experimental groups： groups of experimental dogs in 0.5 h GnRH， SS concentration in plasma decreased obviously， with the extension of time after GnRH， SS concentration showed a trend of increasing；2. Ter minal ileum tissue after GnRH receptors， SS receptor expression changes： GnRHR， expression of SSTR also showed a trend of increase after the first reduce； And receptor and its corresponding concentration has a good consistency. Conclusion Acute ter minal ileitis elevated GnRH， SS concentration in plasma and its receptor expression， GnRH， SS and their receptors are involved in the regulation of acute ter minal ileitis.

acute ter minal ileitis； stress； GnRH； SS； receptor.

R574

A

1673-016X（2016）02-0049-04

2015-10-10

周国华，E-mail：Zgh169@aliyun.com