急性淋巴细胞白血病nm23-H1蛋白的表达及其同免疫分型的相关性

任 羽，贺爱军，葛繁梅

（延安大学附属医院，延安 716000）

急性淋巴细胞白血病nm23-H1蛋白的表达及其同免疫分型的相关性

任 羽，贺爱军，葛繁梅

（延安大学附属医院，延安 716000）

目的：探讨急性淋巴细胞白血病nm23-H1蛋白的表达及其同免疫分型的相关性。方法：研究对象来自于2013年5月～2015年6月我院血液科收治的ALL患者46例，根据医治情况分为初治组20例，完全缓解组12例，复发组14例。另外选取25例健康体检者为对照组，采用酶联免疫吸附法（ELISA）对nm23-H1基因进行检测，观察nm23-H1蛋白的表达水平与免疫表型的关系。结果：与正常对照组和完全缓解组比较，初治组患者nm 23-H1表达水平明显上升，组间比较存在显著性差异；完全缓解组nm23-H1表达水平与正常对照组相比，差异无显著性。复发组与正常对照组、完全缓解组比较，nm23-H1表达水平显著上升，而与初治组比较则无明显差异。对46例ALL患者进行免疫分型，其中B细胞系ALL26例，nm 23-H1阳性12例，主要表达CD19占100.00%、CD22占57.69%、HLA-DR占15.38%、CD20占23.07%；T细胞系ALL20例，CD7占100. 00%、CD3占30.00%、CD5占35.00%、CD22占10.00%、CD34占25.00%、HLA-DR占90.00%，20例T细胞系ALL中变异型My + ALLI，主要表达髓系抗原CD33占10.00%，B细胞ALL中未见髓系抗原表达情况。T-ALL组阳性率和nm23-H1表达水平均明显高于B-ALL组，组间比较差异具有显著性意义。结论：nm23-H1高表达可能是影响ALL病患预后的一个危险因素，nm23-H1基因可能是未来治疗ALL的一个有效分子靶点，可以作为ALL临床诊断的指标，对观察ALL病情变化及评估预后具有重要的临床意义。

急性淋巴细胞白血病；nm23-H1；免疫分型；相关性

有关研究表明，nm23基因与肿瘤转移呈密切相关性，其不仅能够控制多种肿瘤细胞的转移和扩展，还具有抑制细胞繁殖、有利于细胞分化以及促进细胞自主死亡等调控功能［1］。其中nm23-H1蛋白在造血系统恶性肿瘤中的过度表达，可能与疾病的发生发展及预后相关，为了进一步了解nm23-H1蛋白在急性淋巴细胞白血病（ALL）中的作用，本文对ALL患者血浆中的nm-23H1蛋白进行了检测，探讨其在ALL中的表达和临床意义，同时对nm-23H1蛋白表达水平与ALL免疫分型的相关性进行了分析，现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 研究对象来自于2013年5月～2015年6月我院血液科收治的ALL患者46例，全部患者均经骨髓细胞及细胞化学或免疫分型检查确诊为ALL［2］。本组病患中男27例，女19例；年龄6～71岁，平均年龄38.5岁。将此46例患者根据医治情况分为初治组20例，完全缓解组12例，复发组14例。另外选取25例健康体检者为对照组，其中男23例，女18例；年龄7～69岁，平均年龄38岁。比较各组以上临床资料无明显差异（P＞0.05），具可比性。

1.2 标本的采集 检测nm23-H1基因的标本采集：于化疗前对初治组及复发组病例进行外周血收集；于首次强化治疗前对完全缓解组的病例进行外周血采集；对照组收集体检时的外周血，均采用肝素抗凝管分别收集各组血液量4 mL。免疫分型的标本采集：所有病例于化疗前行髂骨穿刺采集骨髓液5 mL，无菌肝素抗凝，必须骨髓原始+幼稚细胞≥80%［3］。

1.3 血浆的制备 取静脉血4 mL，无菌肝素抗凝（100U/ mL），静置于冰上l0 min以上，通过离心仪器于4℃下，设置2000r/min的转速离心5 min，之后采用0.22um滤膜过滤，提取血浆，分置两个EP管中，储存于-80℃。

1.4 检测方法 采用酶联免疫吸附法（ELISA）对nm23-H1基因进行检测，试剂盒来自上海酶研生物科技有限公司，根据试剂盒的说明书的时间和温度实施操作。取出各组待检测的血浆标本于37℃温度下孵育30 min，并以相应量的96孔板进行标记。首先取nm23-H1基因标准品1支，加入500µL稀释液在1 mL小离心管内混匀为A管，含标准品的量为250ng/ mL，此外再取7支1 mL小离心管，分别为B、C、D、E、F、G、H管，在每个离心管内加入250µL样品液，标准品的浓度从A管吸取250µL加入B管，混匀（B：125ng/ mL），依次倍比稀释至G管（C：62.5ng/ mL，D：31.25ng/ mL， E：15.6 ng/ mL，F：7.8 ng/ mL，G：3.9 ng/ mL）［4］，H管为零对照管。按照说明书进行加样，分别在每个样品孔内加入50 mL稀释液以及待测血浆，各标准品每孔加100 mL做复孔，接着每孔注入多抗100µL，空白孔不加样，37℃下孵育1h。每个孔采用清洗液300 mL洗板4次，最后在干净的吸水纸上拍干。各孔加酶标抗体100 mL，37`C条件下孵育45 min，同上洗板4次。各孔加显色液A50 mL，显色液B50 mL/孔（先加A液再加B液），37℃温育15 min（从加B液算时间）。各孔加终止液100 mL。测定450nm处的OD值，样品孔的OD值=所测得OD值一空白孔OD值，测定样品浓度。

1.5 免疫分型 治疗前取骨髓液5 mL，制备EDTA-K2抗凝骨髓液，送流式细胞仪检查。将EDTA-K2抗凝骨髓液，用300目尼龙网过滤，常规分离单个核细胞，以单抗标记染色15 min后，加入溶血剂1 mL混匀，10 min后流式细胞仪检测，采取活细胞直接荧光免疫技术，以CD45/SSC双参数散点图设门，每测定管1x104以上细胞，测定前以标准校正荧光微球校正仪器，采用Ce1lQuest收集分析。分型所用单抗包括，B淋巴系统有CD19、CD20、CD22；T淋巴系统有CD3、 CD5、CD7；髓系有CD33；干细胞/祖细胞系：CD34、HLA-DR。阳性标准：荧光细胞≥20%，CD34 ＞10%。

1.6 统计学方法 本研究所得数据采用均数±标准差表示，各组nm23-H1蛋白表达水平比较用方差分析和t检验，计数资料采用率（%）表示并行χ2检验，P＜0.05表示组间数据差异显著，以上数据运用SPSS22.0软件包处理完成。

2 结果

2.1 nm 23-H1在不同病期ALL中的表达 与正常对照组和完全缓解组比较，初治组患者nm 23-H1表达水平明显上升，组间比较存在显著性差异（P＜0.01）；完全缓解组nm23-H1表达水平与正常对照组相比，差异无显著性（P＞0.05）。复发组与正常对照组、完全缓解组比较，nm23-H1表达水平显著上升（P＜0.01），而与初治组比较则无明显差异（P＞0.05）。详见表1。

表1 nm 23-H1在不同病期ALL中的表达

2.2 nm23-H1表达水平与免疫分型的关系 对46例ALL患者进行免疫分型，其中B细胞系ALL26例，nm 23-H1阳性12例，主要表达CD19占100.00%、CD22 占57.69%、HLA-DR占15.38%、CD20占23.07%；T细胞系ALL20例，CD7占100. 00%、CD3占30.00%、CD5占35.00%、CD22占10.00%、CD34占25.00%、HLA-DR占90.00%，20例T细胞系ALL中变异型My + ALLI，主要表达髓系抗原CD33占10.00%，B细胞ALL中未见髓系抗原表达情况。详见表2。

表2 nm23-H1表达水平与免疫分型的关系

2.3 nm23-H1在不同类型ALL中的表达 T-ALL组阳性率和nm23-H1表达水平均明显高于B-ALL组，组间比较差异具有显著性意义（P＜0.05）。详见表3。

表3 nm23-H1在不同类型ALL中的表达

3 讨论

近年来研究发现，nm23-H1蛋白的表达与某些肿瘤的转移潜力成反比，因此称为转移抑制基因，其表达的降低与乳腺癌、肝癌、卵巢癌等多种恶性肿瘤的高转移性和疾病恶化呈相关性。nm23-H1抑制肿瘤转移的机制包括以下几点［5］：①nm23-H1基因编码分泌的蛋白质与二磷酸核苷激酶（NDPK）氨基酸顺序具有本质上的相似性，能够将结合于蛋白质上的二磷酸核苷（NDP）磷酸化成三磷酸核苷（NTP），对细胞内NTP区域的大小和细胞分裂起到调节的作用。nm23-H1中的一个对偶基因凋亡都可能引起NDPK的A、B两亚单位比例失衡，NDPK由此发生变化，不仅会造成NTP分泌量减少，进一步影响微管结合，最终导致染色体发生畸变和非整倍体形成，因此促进了肿瘤转移。同时还有助于细胞骨架和微管结合或G蛋白介导的对细胞素信号反应的改变，导致细胞运动发生变化，有利于浸润发展［6］。②nm23-H1蛋白的氨基酸序列中具有3个左右的亮氨酸拉链结构，可驱使蛋白二聚体的产生，此类型二聚体由碱性氨基酸的扩展与DNA聚集，因此nm23-H1蛋白也可能以转录激活因子起到效果，产生调节作用。③nm23-H1蛋白丝氨酸磷酸化能够阻碍细胞信号的传递而发挥抑制转移的功能［7］。有关研究显示，nm23-H1蛋白又是数种造血系统恶性肿瘤的分化抑制因子，nm23-H1基因能抑制白血病细胞的分化，与白血病细胞的恶性繁殖有关，因此与白血病耐药、复发及预后均呈密切相关性。nm23-H1基因的低表达伴随着细胞分化及成熟，而高表达则抑制了白血病细胞的分化［8］。

ALL是由于免疫表型细胞在骨髓内异常增生的恶性克隆性疾病之一［9-10］。按照ALL免疫表型可分为B系、T系及T/B混合系细胞。其中T系ALL在ALL总发病率中占据约达24%左右，其有着与B系ALL完全不同的免疫学、细胞遗传学及分子生物学的特异性［11］。本研究结果数据显示，与正常对照组和完全缓解组比较，初治组患者nm 23-H1表达水平明显上升，组间比较存在显著性差异；完全缓解组nm23-H1表达水平与正常对照组相比，差异无显著性。复发组与正常对照组、完全缓解组比较，nm23-H1表达水平显著上升，而与初治组比较则无明显差异。进一步说明nm23-H1蛋白与ALL关系密切。T-ALL组nm23-H1表达水平明显高于B-ALL组，组间比较差异具有显著性意义。由此可见nm23-H1蛋白在T系ALL中表达水平较高，这与ALL易发作及预后差有关。T-ALL组20例中，nm23-H1蛋白阳性17例，阳性率为85.0%，B-ALL 组26例，nm23-H1蛋白阳性12例，阳性率为46.1%，二者差异具有显著性意义，此结果与大量研究报道T-ALL比B-ALL临床效果差及改善率低相一致［12］。

综上所述，nm23-H1高表达可能是影响ALL病患预后的一个危险因素，nm23-H1基因可能是未来治疗ALL的一个有效分子靶点，可以作为ALL临床诊断的指标，对观察ALL病情变化及评估预后具有重要的临床意义。

［1］ 杨晨， 杨林花， 张耀方， 等. 急性髓细胞白血病与CD25 表达的相关性探讨［J］. 中国现代医生， 2014， 52（14）： 20-23.

［2］ 李海燕， 刘洁生， 王一飞. nm23-H1与白血病和淋巴瘤的预后关系［J］. 生理学进展， 2003， 1（34）： 74-77.

［3］ 裴仁， 治陆滢， 张丕胜， 等. Ph+急性淋巴细胞白血病与慢性粒细胞白血病急淋变的临床特征分析［J］. 中国现代医生， 2014， 52（34）：35-38.

［4］ 吴少玲， 赵新东， 赵洪国， 等. 急性淋巴细胞白血病患者nm23-H1mRNA表达及临床意义［J］. 白血病淋巴瘤， 2002， 2（11）： 102-103.

［5］ Korabiowska M， H nig JF， Jawien J， Knapik J， Stachura J， Cordon-Cardo C， et al. Relationship of nm23 expression to proliferationand prognosis in malignant melanomas of the oral cavity［J］. In Vivo， 2005，19（6）： 1093-1096.

［6］ 孟庆祥， 姜容， 杨保青， 等. 分化抑制因子nm23基因在急性白血病细胞中的表达及临床意义［J］. 中华血液杂志， 2003， 7（24）： 369-371.

［7］ Nittsu N， Honma Y， Lij IMA K， et al. Clinical significance of nm23 -H1 proteins expressed on cell surface in non -Hodgkin's lym- phoma ［J］. Leukemia， 2003， 17 （1）： 196 - 202.

［8］ 黄光辉， 储兵， 陈应智， 等. 免疫组织化学在急性白血病骨髓活检中的应用［J］. 中国现代医生， 2009， 47（22）： 93-95.

［9］ NIXH， Gu SH， Dai JL， et a. Isolation and characterization of anovelhuman NM23-H1 B gene， a different transcrip tion of Nm23-H1［J］. JHum Genet， 2003， 48 （2）： 96-100.

［10］ Chen XF， Zhang HT， Qi QY， et al. Expression of E-cadherin andnm23 is associated with the clinicopathological factors fo human non- small cell lung cancer in China［J］. Lung Cancer， 2005， 48 （1）： 69-76.

［11］ 杨惠军，黄彦勤，李婉丽. 儿童急性淋巴细胞白血病beclin-1的表达及意义［J］. 湖南师范大学学报（医学版）， 2011， 8（1）： 12-16.

［12］ 张世恒，刘伶，杨月明，等. 培门冬酶在儿童急性淋巴细胞白血病诱导化疗中的应用研究［J］. 湖南师范大学学报（医学版）， 2015，9（1）： 95-97.

Expression of nm23-H1 protein in acute lymphoblastic leukemia and its correlation with the immune typing

Ren Yu， He Ai-jun， Ge Fan-mei
（Yanan University Affiliated Hospital，Yanan 716000 China）

Objective To investigate the expression of nm23-H1 protein in acute lymphoblastic leukemia and its correlation with the immune typing. Methods from May 2013 ～2015 June， 46 patients with ALL treated in our hospital were divided into 20 groups according to the treatment， 12 cases in the complete remission group and 14 cases in the recurrent group. In the control group， gene was detected by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）， and the relationship between the expression level of nm23-H1 protein and the expression level of nm23-H1 gene was observed. Results compared with the normal control group and complete remission group， the expression level of 23-H1 nm in the initial treatment group was significantly higher than that in the control group. The expression level of nm23-H1 in the complete remission group was not significantly different from the normal control group. The expression level of nm23-H1 was significantly increased in the recurrent group， compared with the control group， and the expression level was significantly higher than that in the control group. Was performed in 46 patients with B， including ALL26 cells， cells，23-H1 nm positive， 12 cases， CD19 positive， 57.69%， CD22， HLA-DR， ALL20， 23.07%，， CD7， CD22， 20， ALL， 25%， T， ALL，，100%， CD33，，，，，，，， 10%， My， 90%， ALLI， HLA-DR， B， ALL，，，，，， CD3， CD20， T， CD5， CD34，. The positive rate of T-ALL group and nm23-H1 expression level were significantly higher than that in B-ALL group， the difference was significant. Conclusion high expression of nm23-H1 may be a risk factor for the prognosis of patients with ALL disease. Nm23-H1 gene may be an effective molecular target for the treatment of ALL in the future. It can be used as an indicator of ALL clinical diagnosis. It has important clinical significance to observe the changes of ALL and evaluate prognosis.

acute lymphoblastic leukemia； nm23-H1； immune typing； correlation

R733.711

A

1673-016X（2016）02-0096-04

2015-08-20

任羽，E-mail： 735690074@qq.com