多型FMDV VP1表位嵌入型载体pMG-SLPMultiVP1的构建及其表达产物鉴定

陆继爽，黄天鹏，吴　咪，贺海燕，格日勒图

(内蒙古农业大学兽医学院，内蒙古呼和浩特 010018)



多型FMDV VP1表位嵌入型载体pMG-SLPMultiVP1的构建及其表达产物鉴定

陆继爽，黄天鹏，吴咪，贺海燕，格日勒图*

(内蒙古农业大学兽医学院，内蒙古呼和浩特 010018)

构建出表达载体pMG-SLPMulti VP1，并对其进行双酶切鉴定及PCR鉴定。将阳性重组质粒转入到发酵乳杆菌中进行表达，并对表达产物进行SDS-PAGE、Western blot和IFAT鉴定。多型FMDV VP1表位嵌入的SLPMulti VP1融合基因成功克隆入穿梭质粒pMG36e中，其表达产物大小约为35 ku,部分表达产物位于发酵乳杆菌表面。成功构建了一个乳杆菌嵌入型表达载体pMG-SLPMulti VP1,为以发酵乳杆菌为活菌载体的表位疫苗研究奠定了基础。

多型口蹄疫病毒；VP1表位；S-层蛋白；发酵乳杆菌；表位疫苗

口蹄疫(Foot-and-mouth disease，FMD)是一种高度接触性传染病，危害猪、牛、羊和鹿等包括野生动物在内的70多种偶蹄动物[1]。FMD的病原是口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus，FMDV )，属于小RNA病毒科口蹄疫病毒属成员。该病毒衣壳由VP1、VP2、VP3和VP4共4种结构蛋白组成，其中VP1蛋白主导病毒与细胞的吸附，还是诱导宿主产生中和抗体的主导抗原[2-5]，所以VP1蛋白是研究FMDV表位疫苗的首选[6]。

在发展中国家，预防FMD一直以来都应用灭活疫苗[7]。由于FMDV各型之间没有交叉保护，所以在疫苗使用的实践中发现，用灭活疫苗难以完全应对FMD的挑战。加之灭活疫苗对病毒纯度和生产条件要求极高(如灭活不完全，甚至有引发疫情的潜在风险)[8-9]，所以研制新型疫苗已经成为FMD疫苗研究的热点。尤其是表位疫苗，由于其分子结构小、操作简单并且可以研制多价苗、联苗等特点而受到国内外研究者广泛的关注[10]。

S-层蛋白(S-layer protein，SLP)已在400多种细菌及古细菌细胞壁表面发现，它是一种由单分子蛋白亚基构成的疏水性碱性蛋白[11]，而且还是使细菌黏附到细胞表面的关键[12]。它能在菌体表面自主形成纳米级规则晶格的单分子表面保护层，且通过非共价键形式与细胞壁相连[13-14]。S-层蛋白这种黏附性和形成纳米级晶格的特点被应用到许多研究当中[15-16]，在分子纳米技术、仿生学和医学等领域都具有广泛的应用前景。

本研究将A型、O型和Asia 1型FMDV的VP1特定表位基因嵌入到发酵乳杆菌S-层蛋白当中，构建出乳杆菌表达载体pMG-SLPMultiVP1，并转化到发酵乳杆菌中进行表达，应用SDS-PAGE、Western blot以及IFAT鉴定其表达产物。本研究为进一步研究各型FMDV VP1表位基因嵌入型多价表位疫苗奠定基础。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株与质粒大肠埃希菌DH5α、表达载体pMG36e、发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)；鼠源多型FMDV(A、O和Asia 1型)高免血清；重组质粒pMD-SLPM ultiVP1，均由内蒙古农业大学兽医学院分子生物平台工程菌实验室制备或保存。

1.1.2试剂T4 DNA连接酶，New England Biolabs公司产品；DNA Marker DL 5 000、限制性内切酶SacⅠ、Hind Ⅲ、蛋白分子质量标准及PCR相关试剂，宝生物工程(大连)有限公司产品；AxyPrep质粒小量提取试剂盒、AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒，康宁生命科学有限公司产品；红霉素，Sigma公司产品；牛源多型FMDV(A、O和Asia 1型)疫苗株阳性血清，中国农业科学院兰州兽医研究所提供；兔抗牛IgG-HRP，北京博奥森生物技术有限公司产品；Alexa Fluor 488标记驴抗鼠IgG，Jackson Immuno Research产品。

1.2方法

1.2.1引物及其合成引物序列如下：PF：5′ -CCGAGCTCGTGAAAAAAAAGATTATCTCAGCTA-3′;PR：5′- ATGAAGCTTTTATAGTTCGCGACGA-3′。引物由上海桑尼生物工程有限公司合成。

1.2.2重组表达载体pMG-SLPMultiVP1的构建应用PF和PR引物，以含有Usp45-SLP-VP1基因的重组质粒pMD-SLPMultiVP1为模板，进行PCR扩增。PCR反应条件为：94℃ 5 min；94℃ 1 min，56℃ 1 min，72℃ 1 min，共30个循环；72℃ 10 min。

将PCR产物SLPMultiVP1及表达载体pMG36e分别用限制性内切酶SacⅠ、Hind Ⅲ酶切，10 g/L琼脂糖凝胶电泳。用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒纯化SLPMultiVP1 DNA片段和pMG36e酶切产物，用T4连接酶将两胶回收产物进行黏性末端连接。连接体系(10 μL)：SLPMultiVP1基因3.0 μL，pMG36e载体1.0 μL，T4 DNA连接酶1.0 μL ，10×T4 DNA连接酶buffer 1.0 μL，ddH2O 4.0 μL。4℃连接过夜。连接产物转化至大肠埃希菌DH5α中，并在含200 μg/mL红霉素的普通LB固体培养基上进行阳性克隆筛选。

1.2.3重组质粒pMG-SLPMultiVP1的鉴定挑取阳性克隆菌落，接种至含红霉素的LB液体培养基中培养过夜，用AxyPrep质粒小量提取试剂盒提取重组质粒pMG-SLPMultiVP1。随后对重组质粒进行PCR和双酶切鉴定，各取5 μL PCR产物和酶切产物，10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.4重组质粒pMG-SLPMultiVP1的电转化

1.2.4.1发酵乳杆菌感受态细胞的制备将发酵乳杆菌单菌落接到5 mL MRS液体培养基中，37℃静置培养过夜后，接种2 mL于100 mL含25 g/L甘氨酸的SMRS(含0.5 mol/L蔗糖)培养基中，37℃静置培养，每隔2 h取样，监测其OD 600 nm，直至达到0.4～0.6。随后将菌液冰浴20 min，6 000 r/min离心10 min，用预冷的PB(0.5 mol/L蔗糖、100 mL/L甘油)缓冲液洗涤3次后，再用8 mL PB缓冲液重悬，200 μL分装至1.5 mL离心管，用液氮速冻，置于-80℃冰箱保存。

1.2.4.2重组质粒以及pMG36e质粒的电转化将发酵乳杆菌感受态细胞从-80℃冰箱中取出置于冰上，待融化后分别加入1 μL 重组质粒pMG-SLPMultiVP1和pMG36e质粒，混匀后冰浴20 min，将其分别加入预冷的电转化杯中。电转化条件为：电压2.4 kV，时间4 ms。电击完毕后迅速将电转化产物加入到1 mL SMRS(含MgCl2和CaCl2)复苏培养基中，37℃温浴2 h～3 h。4 000 r/ min离心5 min，取200 μL上清，其余上清弃掉，悬浮沉淀菌体，涂布于含10 μg/mL红霉素的MRS固体平板上，在37℃恒温培养箱倒置培养36 h～48 h。

1.2.5发酵乳杆菌中pMG-SLPMultiVP1表达及其鉴定

1.2.5.1SDS-PAGE及Western blot鉴定挑取含重组质粒pMG-SLPMultiVP1以及pMG36e质粒的发酵乳杆菌可疑菌落，接种于含红霉素的MRS液体培养基中，培养36 h～48 h。12 000 r/min离心3 min收集菌体，加入1×SDS上样缓冲液悬浮混匀，煮沸5 min，冰浴5 min，12 000 r/min离心5 min，取上清进行SDS-PAGE电泳。以牛源多型FMDV疫苗株阳性血清作为一抗，兔抗牛IgG-HRP为二抗，ECL显色法对表达产物进行Western blot检测。

1.2.5.2IFAT鉴定将培养好的发酵乳杆菌4℃ 5 000 r/min离心5 min，弃净培养基，用PBS清洗2次菌体后，反复稀释，调节菌浊度OD 600 nm至1.0。取干净的载玻片(镜检无杂物)，加30 μL多聚赖氨酸，常温静置30 min，吸去多余液体后，加入40 μL调好的菌液，静置20 min，再吸去多余菌液，加40 g/L多聚甲醛20 μL，常温静置15 min，PBS洗1次，加1∶100(V/V)稀释的一抗(鼠源多型FMDV高免血清)20 μL，常温避光作用45 min，PBS洗2次，之后再加20 μL 1∶100(V/V)稀释的荧光标记二抗(Alexa Fluor 488标记驴抗鼠IgG)，常温避光作用30 min，PBS洗3次，最后用荧光显微镜观察菌体发光情况，拍照留存。

2　结果

2.1SLPMultiVP1设计

该融合基因SLPMultiVP1包含信号肽、SLP、VP1型特异性表位基因(A、O、Asia Ⅰ)以及葡萄球菌A蛋白(Staphylococcalprotein A，SPA)的细胞膜上锚定部分，简称LPXTG。该嵌入基因组成结果如图1所示。

2.2重组质粒pMG-SLPMultiVP1的PCR及双酶切鉴定

PCR扩增出约900 bp特异性SLPMultiVP1基因片段，与预期结果一致(图2)，这也进一步证明了目的基因插入方向是正确的。

用限制性内切酶SacⅠ和Hind Ⅲ双酶切重组质粒得到2个片段，大小分别约为3 600 bp和900 bp，大片段为载体片段，小片段为目的基因片段。这表明目的基因已正确插入到表达载体pMG36e中。

图1　pMG-SLPMultiVP1设计结果

M.DNA 标准DL 5 000;1.重组质粒pMG-SLPMultiVP1；2.重组质粒PCR产物；3.重组质粒酶切(SacⅠ/Hind Ⅲ)产物

M.DNA Marker DL 5 000;1.Recombinant plasmid pMG-SLPMultiVP1；2.PCR products of recombinant plasmid pMG-SLPMultiVP1；3.Products of recombinant plasmid pMG-SLPMultiVP1 digested bySacⅠandHind Ⅲ

图2重组质粒PCR及双酶切鉴定

Fig.2Identification of recombinant plasmid pMG-SLPMultiVP1 by PCR and double enzyme digestion

2.3SLPMultiVP1蛋白在发酵乳杆菌中的表达及鉴定

2.3.1SDS-PAGE和Western blot试验结果SDS-PAGE结果表明，重组发酵乳杆菌在35 ku处未出现明显的可疑条带，可能是因为该重组蛋白与发酵乳杆菌的某个菌体蛋白大小接近，条带与其重合(图3)或重组蛋白分子质量大小发生变化。

应用ECL显色法，将发酵乳杆菌表达产物与多型FMDV疫苗株血清进行Western blot检测，显色结果显示，FMDV阳性血清识别的蛋白条带有2条，分子质量分别为70 ku和35 ku，70 ku的条带恰好为理论值的2倍，而对照组则未出现任何可疑条带(图3)。

2.3.2IFAT结果将按1.2.5.2方法处理好的2个载玻片(一个样品含pMG-SLPMultiVP1质粒，另一样品含pMG36e)分别置于荧光显微镜下观察，结果发现，重组发酵乳杆菌(含pMG-SLPMultiVP1质粒)出现了较强的绿色荧光(图4A)，但对照的发酵乳杆菌(含pMG36e质粒)则没有相应的荧光(图4C)。此外，不激发荧光观察时发现，重组发酵乳杆菌与对照组比较黏附性明显增强，菌体相互黏附在一起(图4B和图4D)。

M.蛋白分子质量标准；1.SLPMultiVP1蛋白表达；2.pMG36e空载体;3～4.SLPMultiVP1蛋白表达；5～6.PMG36e空载体

M.Protein molecular weight Marker;1.SLPMultiVP1 protein expression；2.pMG36e empty vector;3-4.SLPMultiVP1 protein expression；5-6.pMG36e empty vector

图3表达产物的SDS-PAGE(左)和Western blot(右)分析结果

Fig.3SDS-PAGE(Left) and Western blot(Right) analysis results of the expressed products

A.重组乳杆菌激发荧光；B.重组乳杆菌未激发荧光；C.对照组激发荧光；D.对照组未激发荧光

A.Fluorescent recombinantLactobacillus;B.Non-fluorescent recombinantLactobacillus; C.Fluorescent control group;D.Non-fluorescent control group

图4IFAT结果

Fig.4The results of IFAT

3　讨论

目前，正在使用和研究的FMD疫苗主要有灭活疫苗和新型基因疫苗(表位肽疫苗等)两类。FMD灭活疫苗主要是把田间毒株经病毒培养扩增和灭活剂处理后再添加佐剂制成的[17]。随着生产技术不断发展，人们用超滤法浓缩抗原，取代氯仿处理或氢氧化铝凝胶吸附[18]；用二乙酰亚胺(BEI)取代甲醛对FMDV进行灭活[19]。虽然提高了FMD灭活疫苗的生产效率和安全性，但是FMD灭活疫苗还存在热稳定性差、免疫周期短、灭活不彻底可能会使病毒扩散等危险。为了克服这些问题，表位肽疫苗等新型基因疫苗应运而生。根据诸多报道，VP1蛋白是诱导机体产生免疫反应的主要蛋白之一，而许多表位疫苗的免疫原性就是基于其能递呈VP1蛋白G-H环上关键抗原表位[5]。Hua B等[20]把在霍乱毒素B亚单位(CT-B)的杆状细菌(Bacillussubtilis)插入并表达了Asia 1型FMDV 的抗原表位，构建成功1A751/CTB-TepiAs重组菌可饲疫苗。结果显示，对豚鼠加强免疫后能够保护豚鼠抵抗FMDV的攻击。本研究成功构建pMG-SLPMultiVP1载体，将FMDV多型表位嵌入到S-层蛋白质中，利用发酵乳杆菌作为活菌载体，分泌表达的靶基因产物SLPMultiVP1融合蛋白则能锚定在乳杆菌表面。其主要特点为表达产物不需要进行纯化，乳杆菌活菌携带这些表位，经口服后直接到达胃肠道淋巴细胞产生有效的免疫应答，其中S-层蛋白具有加强黏附作用和潜在的佐剂效应。

在本试验结果中，FMDV嵌入型蛋白SLPMultiVP1的理论值约为35 ku(含信号肽约为2 ku)。然而在SDS-PAGE结果中，相应位置未出现明显目的条带，可在Western blot结果中发现，约在70 ku和35 ku处出现特异性反应条带，而对照组相应位置未出现反应条带，其中70 ku恰好是理论值的2倍，可能为目的蛋白的二聚体。嵌入型蛋白SLPMultiVP1的二聚体形成的原因尚还不清楚，与S-蛋白的疏水性氨基酸残基相互作用还是融合蛋白的特性所致的，需要进一步试验来证实。而在IFAT中，含重组质粒的发酵乳杆菌与对照组(含有pMG36e)相比较，大多数乳杆菌明显聚集在一起(图4B)，表明发酵乳杆菌的黏附性加强，该结果提示，SLP蛋白可能部分表达在发酵乳杆菌表面上，相继试验中激发荧光后，试验组一部分菌明显发光，而对照组则不发光，但是试验组发光者数量不多，其原因有以下三点：①pMG36e载体是非诱导型载体，表达水平有限；②pMG36e载体在发酵乳杆菌中表现为低拷贝；③SLP蛋白的折叠可能影响FMDV部分表位与疫苗株阳性血清的有效结合。

本试验选择穿梭质粒pMG36e为表达载体，构建了pMG-SLPMultiVP1，并成功在发酵乳杆菌中进行表达，为今后多型FMDV表位疫苗的研制奠定了基础。

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Construction of Multi-type FMDV VP1 Epitope Embedded Vector pMG-SLPMultiVP1 and Identification of Its Expressed Products

LU Ji-shuang，HUANG Tian-peng，WU Mi，HE Hai-yan，Geriletu

(CollageofVeterinaryMedicine,InnerMongoliaAgricultureUniversity,Hohhot,InnerMongolia,010018,China)

In this paper,the expression vector pMG-SLPMultiVP1 was constructed and identified by method of double enzyme digestion and PCR.The positive recombinant plasmid was transformed intoLactobacillusfermentum and the expression of SLPMulti VP1 fusion protein was confirmed by SDS-PAGE,Western blot and IFAT respectively.Multi-type FMDV VP1 epitope embedded SLPMultiVP1 fusion gene was successfully cloned into shuttle plasmid pMG36e,whose expression product was about 35 ku,and part of which was located on the surface ofLactobacillusfermentum.ALactobacillusembedded expression vector pMG-SLPMulti VP1 was successfully constructed.This research laid the foundation for the research on epitope vaccine of which live carrier based onLactobacillusfermentum.

multi-type FMDV;VP1 epitope;S-layer protein;Lactobacillusfermentum;epitope vaccine

2016-03-09

国家自然科学基金项目(31360602)

陆继爽(1989-)，男，山东东平人，硕士，主要从事兽医微生物与免疫学研究。*通讯作者

S852.659.6；Q789

A

1007-5038(2016)10-0006-05