猪圆环病毒2b亚型的分离鉴定及基因组序列分析

李　超，李大军，郑　华，张邑帆，曾仁权，杨　柳*

( 1.重庆市畜牧科学院，重庆荣昌 402460； 2.西南大学荣昌校区，重庆荣昌 402460；3.农业部养猪科学重点实验室，重庆荣昌 402460 )



研究论文

猪圆环病毒2b亚型的分离鉴定及基因组序列分析

李超2，李大军1,3，郑华1,3，张邑帆1,3，曾仁权2，杨柳1,3*

( 1.重庆市畜牧科学院，重庆荣昌 402460； 2.西南大学荣昌校区，重庆荣昌 402460；3.农业部养猪科学重点实验室，重庆荣昌 402460 )

为分离鉴定流行于重庆某猪场的猪圆环病毒2型，本研究从断奶仔猪多系统衰竭综合征猪的淋巴结病料中进行病毒学检测，病毒利用PK-15细胞增殖，其基因组序列经克隆、测序、拼接获得，并完成对全序列的生物信息学分析鉴定。结果获得了1株猪圆环病毒2型 (命名PCV-2 CQ1)，该毒株的全序列大小为1 767 bp，同源性分析发现该病毒与国内公布的PCV-2毒株同源性超过了90%，尤其与广西分离株同源性达100%；系统进化分析本分离病毒与浙江株(EU257511)、黑龙江株(HM038032)聚类到一起，形成一个进化分支，同属于PCV-2b型；对编码的衣壳蛋白分析发现，PCV-2 CQ1 Cap氨基酸发生了较大变异，与强毒株同源性较高，考虑到本病毒源自PMWS病猪，推测该毒株属于强毒株。

猪圆环病毒2型；分离鉴定；序列分析

猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV-2)是一种单股环状DNA病毒，是引起猪圆环病毒感染的主要病原。临床上猪圆环病毒感染主要表现为仔猪断奶后多系统衰竭综合征(Postweanig multisystemic wasting syndrome,PMWS)[1]、猪皮炎与肾病综合征(Porcine dermatitis and nephropathy syndrome,PDNS)、仔猪先天性震颤(Congenital tremors,CT)、呼吸道、消化道症状和繁殖障碍等[2]。由PCV-2引起的PMWS是公认的危害全球养猪业的重大经济性疾病，同时也是我国养猪业继猪瘟和猪繁殖与呼吸综合征之后的重要传染病，每年给养猪业造成了重大的损失[3]。

PCV-2常与猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)、猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)、猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)等混合感染。PCV-2可分为PCV-2a、PCV-2b、PCV-2c、PCV-2d、PCV-2e 5个基因型，有学者从无PMWS症状猪和有明显PMWS症状猪中均分离到了PCV-2，说明了不同型PCV-2之间的毒力不同[4]。PCV-2含11个开放阅读框(open reading fame,ORF)，其中ORF1、ORF2为最主要的阅读框。ORF1编码与病毒复制相关的蛋白(replication related protein,Rep)，ORF2编码病毒衣壳蛋白(capsid protein,Cap)。衣壳蛋白是PCV-2主要的靶抗原，具有较强免疫原性，是目前猪圆环病毒新型诊断技术与基因工程疫苗研发的重要抗原。

本研究从重庆地区某猪场具有典型PMWS症状的猪体中分离鉴定了1株PCV-2，命名为PCV-2重庆分离株(PCV-2 CQ1)，分析了该毒株的遗传进化情况，并对其致病性进行初步预测，为进一步研究奠定了基础。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1试剂与细胞系DNA病毒基因组提取试剂盒、PCR扩增试剂盒，OMEGA公司产品；胎牛血清、DMEM培养液，Gibco公司产品；PK-15细胞，重庆市畜牧科学院兽医研究所保存。1.1.2引物根据已发表的PCV-2序列(AY556475)设计3对引物：1st对：F1 5′ -AGTGAGCGGGAAAATGCAGA-3′，R1 5′-TCCTCCGTGGATTGTTCTGT-3′；2nd 对：F2 5′-ATAATCCTTCCGAAGACGAG-3′，R2 5′-TAAGGTTGAATTCTG GCCCT-3′；3rd对：F3 5′-GTGAGGGCTGTGGCCTTTGT -3′，R3 5′-TCGCTTTCTCGATGTGGCAG-3′。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.2方法

1.2.1病毒学检查疑似感染PCV-2的发病猪，源自重庆某养猪场，病猪多为断奶猪和育肥生长猪。临床观察，有明显皮炎，皮肤上出现大小不等的圆形或不规则斑块；病猪表现为生长缓慢、呼吸急迫、消瘦、贫血、出现黄疸等[5]。剖检后发现有淋巴结肿大、肝硬变、多灶性黏液性气管炎、间质性肺炎和肾炎。参照文献[6] ，在无菌环境下，将淋巴结加入5倍体积灭菌的磷酸缓冲液研磨，用0.22 μm滤膜过滤后，取一定量的病毒滤液，按照病毒基因组提取试剂盒提取病毒DNA，进行PCR，反应条件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，循环30次；最后72 ℃ 10 min。PCR产物用10 g/L琼脂糖凝胶电泳分析，阳性PCR产物进行测序鉴定。

1.2.2病毒的增殖参考文献[7]，将病毒学检测阳性的病料滤液接种至单层PK-15细胞上， 37 ℃处理2 h，移弃病毒液体，换成含20 mL/L胎牛血清的DMEM培养液，继续培养2 d，将培养瓶放入-20 ℃冰箱内反复冻融3次，离心收集病毒液，0.22 μm滤膜过滤，收集病毒液置-80 ℃保存。

1.2.3全基因组DNA序列的测定取0.5 mL细胞裂解液，提取病毒基因组。取1.5 μL为模板，分别以设计的3对引物进行PCR，反应条件与病毒学检查的相同。PCR产物用10 g/L琼脂糖凝胶电泳，阳性PCR产物测序鉴定，DNA测序片段经连接成病毒全基因组序列。

1.2.4病毒的生物信息分析所得全序列在NCBI上用Blast进行同源性搜索，采用MEGA 4软件中的邻接法，基于PCV-2基因组全序列构建系统进化树。同时进行序列同源性分析，并将本病毒衣壳蛋白与已知的强毒株和弱毒株衣壳蛋白序列进行对比分析。

2　结果

2.1病毒分离培养

剖检临床症状为PMWS的病猪，采集腹股沟淋巴结病料。病料用检测引物(F1,R1)PCR，其产物经电泳显示，获得了大约为420 bp的DNA条带，与预期结果相符(图1)。PCR检测为阳性的病料，用PK-15细胞分离培养病毒；细胞培养物经反复冻融裂解，收集PCV-2，并再次检测确认阳性。

2.2病毒PCV-2 基因组全序列测定

对收集的病毒液，用前述3对引物进行PCR，其产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳，结果见图2，获得了明显的DNA条带。PCR产物经进一步测序鉴定，测序显示各条带大小分别为417、1 318、750 bp，与预期值相符。

M.DNA 标准DL 2 000;1～3.淋巴结病料PCR产物

M.DNA Marker DL 2 000;1-3.PCR products of sample from lymph nodes

图1样品淋巴结含PCV-2 的PCR检测结果

Fig.1PCR identification results of sample lymph nodes containing PCV-2

M.DNA 标准DL 2 000;1.用第1对引物的PCR产物;2.用第2对引物的PCR产物;3.用第3对引物的PCR产物

M.DNA Marker DL 2 000;1.PCR products by the 1st pair of primers;2.PCR products by the 2nd pair of primers;3.PCR products by the 3rd pair of primers

图2细胞培养PCV-2 的PCR鉴定结果

Fig.2PCR identification results of PCV-2 from cell culture

2.3PCV-2 基因组分析

测序的DNA序列经过拼接，获得PCV-2全基因组序列，大小为1 767 bp。经分析该序列碱基构成为：A为25.58% (452 nt)，G为28.13% (497 nt)，T为25.75% (455 nt)，C为20.54% (363 nt)，A+T为51.33%，G+C为48.67%。将该序列与国内各型PCV-2代表株同源性比对分析(图3)。结果显示，该病毒基因组与国内各株病毒同源性较高，均在90%以上，尤其与广西分离株(AY556475)核苷酸同源性高达100%。

2.4遗传进化分析

基于PCV-2 全基因组序列，采用MEGA 4软件中的邻接法，将分离病毒与国内各型PCV-2代表序列共20株进行系统进化分析(图4)。结果发现，PCV-2呈现一定的变异，在我国流行的PCV-2主要分为PCV-2a、PCV-2b、PCV-2c、PCV-2d、PCV-2e共5个基因型，其中PCV-2 CQ1株与浙江株(EU257511)、黑龙江株(HM038032)聚类到一起，形成一个进化分支。这表明本病毒与聚类单元的病毒进化关系最近，同属于PCV-2b型。

图3　国内各PCV-2代表株同源性比对

图4　PCV-2 CQ1分离株与参考毒株的系统进化树

2.5PCV-2 CQ1株衣壳蛋白氨基酸序列变异分析

将本病毒ORF2编码的氨基酸序列与可导致明显PMWS病变的强毒株(virulent)PCV-2- 40489 (AF264042)[8]和无PMWS症状猪中分离的弱毒株(attenuate) PCV-2-4838 (ABD59 348)[9]衣壳蛋白的氨基酸序列进行比对(图 5)。本分离株与强毒株的同源性为92.70%，与弱毒株的同源性为91.85%。PCV-2 CQ1分离株的衣壳蛋白75位天冬酰胺(N)、 76位异亮氨酸(I)、 131位异亮氨酸(I)、134位苏氨酸(T)、206位异亮氨酸(I)与强毒株相同，与弱毒株不同；而59位精氨酸(R)、185位亮氨酸(L)、232位天冬酰胺(N)氨基酸与弱毒株相同，与强毒株不同。

此外，30位由缬氨酸(V)突变为亮氨酸(L)，57位由缬氨酸(V)突变为异亮氨酸(I)，63为突变为赖氨酸(K)，77位由天冬氨酸(D)突变为天冬酰胺(N)，80位由缬氨酸(V)突变为亮氨酸(L)，86位由苏氨酸(T)突变为丝氨酸(S)，88位由赖氨酸(K)突变为脯氨酸(P)、89位由异亮氨酸(I)突变为精氨酸(R)、91位由异亮氨酸(I)突变为缬氨酸(V)，121位由苏氨酸(T)突变为丝氨酸(S)，151由脯氨酸(P)突变为苏氨酸(T)，191由精氨酸(R)突变为甘氨酸(G)，210由天冬氨酸(D)突变为谷氨酸(E)。

下划线部分为预测的免疫反应区域，方框内为发生突变的氨基酸，椭圆内为PCV-2 CQ1株衣壳蛋白氨基酸与强毒株或弱毒株不同的区域

The immune reaction regions of the PCV-2 Cap were the underlined parts,the mutated amino acids were showed in the box parts,the different regions of the Cap between the PCV-2 CQ1 strain and virulent strains or attenuated strains were in the elliptic circles

图5PCV-2 CQ1分离株与PCV-2强毒株或弱毒株衣壳蛋白氨基酸序列的比对

Fig.5The amino acid sequence alignment of capsid proteins between PCV-2 CQ1 strain and PCV-2 virulent strains or attenuated strains

3　讨论

本研究从重庆某猪场的疑似PMWS病猪中分离鉴定了1株PCV-2，该病毒基因组序列与国内的分离株同源性较高(超过90%)，尤其与广西分离株(AY556475)的同源性达到100%。暗示该毒株可能来源于同一地区，并可能已经在重庆和广西两地间相互传播。近些年来，随着国内省市之间商业往来密切，生猪交易事件频繁。因此，迫切需要加强对两地生猪交易的监管，密切注意PCV-2的流行及其的变异，加强和完善对猪圆环病毒感染的防控，以便及时地减小经济损失。

PCV-2 CQ1株全基因组系统进化分析表明，本分离株属于PCV-2b基因型[10]；而根据已有的资料显示，PCV-2b型病毒相比其他型毒株的毒力较强[11]；由此推断本分离株应归类于强毒株。

此外，由于PCV-2 ORF2编码衣壳蛋白是PCV-2的主要结构蛋白，为PCV-2主要的靶抗原，具有较强免疫原性。衣壳蛋白与病毒的致病性、组织噬性以及体外的增殖能力密切相关[12]。PCV-2衣壳蛋白是最易发生变异的区域，常导致病毒致病性的改变。PCV-2衣壳蛋白含3个主要的突变区域(59-80，121-136和180-191)和2个主要的免疫反应区域(65-87, 113-147)[12]。比较分析显示PCV-2 CQ1衣壳蛋白发生一定程度变异即多个氨基酸发生突变，其中有2个位于免疫反应区域内，这种变异是否引起免疫原性的改变，有待进一步研究。由于分离毒株与强毒株的同源性(92.70%)高于弱毒株同源性(91.85%)，加上该病毒株源自明显PMWS临床症状的仔猪。因此，可进一步确认该分离株属于强毒株。但是，为了证明该毒株的致病性，还需要进行动物攻毒试验。

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Isolation,Identification and Genome Sequence Analysis of PCV-2b

LI Chao2, LI Da-jun1,3,ZHENG Hua1,3,ZHANG Yi-fan1,3,ZENG Ren-quan2,YANG Liu1,3

( 1.ChongqingAcademyofAnimalSciences,Rongchang,Chongqing,402460,China;2.RongchangCampusofSouthwestUniversity,Rongchang,Chongqing,402460,China;3.KeyLaboratoryofPigIndustrySciences,MinistryofAgriculture,Rongchang,Chongqing,402460,China)

The purpose of the study was to isolate and identify a PCV-2 prevalent strain in a farm of Chongqing.The virological examination of PCV-2 was carried out from the lymph nodes of piglets with postweanig multisystemic wasting syndrome,PCV-2 in positive samples were propagated and amplified by PK-15,its genome was obtained by cloning,sequencing,sequence-linking.And the whole genome sequence was further analyzed by bioinformatics.The results showed that a PCV-2 strain including 1 767 bp length was isolated (named PCV-2 CQ1).The homology analysis revealed that the similarity between CQ1 strain and domestic

trains was more than 90%.In particular,our isolated strain has 100% similarity to that of Guangxi isolate.Phylogenetic analysis showed this isolate(PCV-2 CQ1),Zhejiang strain(EU257511)and Heilongjiang strain(HM038032)were clustered together,formed a same clade and belonged to PCV-2b.According to the alignment of the amino acid sequence of Cap from the virulent and attenuated strains,the PCV-2 CQ1 has more similarity to the virulent strain.It is presumed that the strain is a virulent strain.

PCV-2;isolation and identification;sequence analysis

2016-03-08

重庆市前沿与应用基础研究计划项目(cstc2014jcyjA80027)；重庆市基本科研业务费项目(15439)

李超(1990-)，男，四川资阳人，硕士，主要从事动物疾病诊断检测技术研究。*通讯作者

S852.659.2

A

1007-5038(2016)10-0001-05