2012年—2015年我国部分地区禽偏肺病毒的分子流行病学分析

朱艳梅,宫　晓,郭伟伟,徐保娟,李陆梅,郎　枫,刘红祥,刘　东,范根成

(动物基因工程疫苗国家重点实验室/青岛易邦生物工程有限公司，山东青岛 266114)



2012年—2015年我国部分地区禽偏肺病毒的分子流行病学分析

朱艳梅,宫晓,郭伟伟,徐保娟,李陆梅,郎枫,刘红祥,刘东,范根成*

(动物基因工程疫苗国家重点实验室/青岛易邦生物工程有限公司，山东青岛 266114)

为了调查鸡群中禽偏肺病毒(aMPV)的流行情况，本研究从江苏、辽宁、河南、山东、河北等地有肿头症状的鸡群中取其鼻甲骨和鼻黏液进行RT-PCR检测，随机选取9株PCR阳性产物对其F基因进行序列测定与遗传进化分析。结果表明，280份病料中检出阳性样品142份，阳性检出率达50.7%；9个试验毒株之间F基因同源性为99.4%～100%，与B型aMPV代表株的同源性为97.7%～99.9%，而与A型、C型和D型aMPV代表株的同源性为71.9%～79.4%；由遗传进化树可见，这9株aMPV均属于B型分支。说明我国鸡群中目前存在aMPV感染，B型毒株是优势流行基因型，从而为禽偏肺病毒疫苗的开发提供了流行病学资料。

禽偏肺病毒；流行病学；F基因；同源性

禽偏肺病毒(Avian metapneumovirus，aMPV)属于副黏病毒科、肺病毒属，是引起鸡肿头综合征的主要病原，其基因组含有8个片段，分别为N、P、M、F、M2、SH、G、L[1]，根据基因差异和血清学分析，aMPV分为A、B、C、D 4个亚型，其中F蛋白是主要的抗原结构蛋白，具有吸附作用，是重要的毒力蛋白和保护性抗原[2-3]。自1978年aMPV首次在南非发现以后，俄罗斯、巴西、以色列、日本以及大多数的欧洲国家等地区均有报道，呈世界范围流行[4]。该病传染性强，传播迅速，能引起多种禽类感染发病并造成严重的经济损失。我国沈瑞忠等[5]1998年在黑龙江某肉鸡场的肿头综合征鸡群中分离到禽偏肺病毒。该病毒主要引起鸡的肿头综合征，以眶下窦肿胀、头部肿胀、打喷嚏、流鼻涕和产蛋率下降等症状为主要特征，感染率可高达100%，病死率随饲养管理和卫生条件而变化，若有混合感染，病死率可高达25%～40%[6]。2012年—2015年期间，从江苏、辽宁、河南、山东、河北等地有肿头症状鸡群中取其鼻甲骨和鼻黏液提取RNA，利用RT-PCR对aMPV F蛋白基因进行扩增并测序，旨在阐明aMPV在我国部分地区的流行状况，为制定禽偏肺病毒防控措施提供可靠依据。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1病料2012年—2015年期间，采集自江苏、辽宁、河南、山东、河北5个省份鸡场中有肿头症状的病料共计280份。

1.1.2试剂 柱式动物病毒RNAout 提取试剂盒，北京天恩泽生物技术有限公司产品；一步法RT-PCR试剂盒、DNA Marker DL 2 000等，宝生物工程(大连)有限公司产品；pGEM-T easy Vector，Promega公司产品；Ampicilin、X-gal、IPTG，Sigma公司产品；Agarose Gel DNA Purification kit (ver.2.0)，宝生物工程(大连)有限公司产品；青霉素、链霉素，山东鲁抗医药股份有限公司产品。

1.2方法

1.2.1鸡只剖检及病料采集从江苏、辽宁、河南、山东、河北地区有肿头症状鸡群中采集其鼻甲骨和鼻黏液，置-20 ℃保存备用。

1.2.2F蛋白基因序列测定

1.2.2.1引物设计参照GenBank已公布的aMPV F蛋白基因片段核苷酸序列，采用Primer 5.0引物设计软件设计扩增aMPV F基因的特异性引物，上游引物为：APVF-F：5′-ATTAGGCAATGGCGTTCGCA-3′；下游引物为：APVF-R：5′-CTCCACCTCTGATGCAACAT-3′。引物由上海Sangon有限公司合成，预期扩增目的片段为590 bp。

1.2.2.2病毒RNA提取和F基因的扩增取250 μL病料悬液，按照柱式动物病毒RNAout提取试剂盒使用说明书流程提取病毒基因组RNA。用APVF-F和APVF-R引物进行一步法RT-PCR。RT-PCR反应条件为：50℃ 30 min；94℃ 2 min；94℃ 30 s，54℃ 30 s，72℃ 40 s，30个循环； 72℃ 7 min；12℃结束反应。10 g/L琼脂糖凝胶进行电泳检测。

1.2.2.3F基因的克隆和序列分析PCR产物回收按Agarose Gel DNA Purification Kit说明书进行，将纯化后的产物按pGEM-T easy Vector说明书进行连接和转化，经AIX平板筛选阳性克隆。挑取2个～3个阳性克隆，送上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。用Megalign和Mega5.0软件对测定的aMPV F蛋白基因序列与GenBank中部分代表性毒株序列进行同源性比较和遗传进化分析。

1.2.3统计分析对不同日龄、品种和省份的鸡群病料，统计PCR阳性率。

2　结果

2.1病鸡症状和剖检变化

发病鸡肿脸肿头，精神沉郁，排黄绿色稀粪(图1A)；剖检的鸡可见头部皮下、眼眶周围组织呈胶冻样浸润，后期呈黄色疏松硬实的肿块(图1B)；部分病鸡头部和肉髯、肉冠的皮下组织，头盖骨的气室和中耳出现肉芽肿和纤维素性化脓性炎症，严重者出现气管炎甚至肺坏死(图1C)；腹部出现急性卵黄性腹膜炎，腹部可见蛋黄和破碎蛋壳(图1D)。

A.头部；B.皮下；C.气管；D.卵黄性腹膜炎

A.Head;B.Subcutaneous;C.Trachea;D.Yolk peritonitis

图1临床发病鸡剖检变化

Fig.1The autopsy pictures of clinically infected chicken

2.2病料RT-PCR检测情况

对采集的样品处理后进行RT-PCR检测，电泳结果显示，样品中(3、4、5、6)检测到目的条带，与预期片段大小(590 bp)相符(图2)。将PCR产物克隆于pGEM-T easy Vector中，将鉴定正确的重组质粒进行测序。对我国部分地区有肿头症状的280份病料进行RT-PCR鉴定，其中有142份样品中可扩增出590 bp左右的片段，阳性检出率为50.7%(表1)。将测序结果与GenBank比对后，结果均为禽偏肺病毒。

M.DNA 标准DL 2 000;1.阳性对照; 2.健康鸡组织对照;3～6.被检测样品

M.DNA Marker DL 2 000;1.Positive control;2.Tissue of healthy chicken;3-6.Tested samples

图2分离株的RT-PCR鉴定

Fig.2RT-PCR identification of strains isolated

2.3统计分析

由表1可以看出，这5个地区发病鸡群阳性率均在40%～64%，差异不明显； 但从日龄上看，150日龄～300日龄的产蛋鸡阳性率明显高于150日龄以内的产蛋鸡；从品种上看，肉种鸡的阳性率明显高于蛋鸡，其中150日龄～300日龄的肉种鸡阳性率最高，发病肉种鸡在产蛋期的PCR阳性率甚至高达100%，说明肉种鸡在产蛋期较易感。

2.4aMPV F蛋白基因核苷酸序列同源性分析

从不同地区RT-PCR阳性样品中随机选取9个试验毒株 F基因的核苷酸进行同源性比较。结果显示，试验毒株之间F基因同源性为99.4%～100%；与2株2010年的B型中国代表株的同源性在99.4%～99.9%之间，与B型意大利株(欧洲株)aMPV/B/IT/Guineafowl/1818/12(gb:KC542808)同源性在97.6%～97.9%之间；而与A型代表株LAH A(gb:AY640317)、 C型代表株GDY(gb:KC915036)、Colarado(gb:AY590688)、France(gb:HG934338)、MN(gb:FJ977568)、D型代表株Fr85.1(gb:HG934339)同源性较低，为72.4%～79.3%。结果显示，这9株分离株均为B型aMPV，并且F基因变异较小(表2)。

2.5F蛋白基因的遗传进化分析

利用Mega5.0对代表株的F蛋白基因进行序列比较，绘制遗传进化树，同样可以看出这9株aMPV均分布在B型分支上(图3)，说明B型aMPV是我国主要流行毒株。

表1　病料RT-PCR阳性检测率Table 1　 The positive rate of samples by RT-PCR

表2　aMPV F基因部分序列同源性分析Table 2　The homology analysis of F gene sequence of avian metapneumovirus

注：1～9为本试验分离株；10～18为各亚型代表株。

Note:1-9.The isolated strains of this experiment;10-18.The representative strains of each subtype.

图3　禽偏肺病毒F蛋白基因遗传进化树

3　讨论

目前许多国家对禽偏肺病毒均有报道，尤其是火鸡饲养国家如美国、墨西哥[7]、埃及[7-8]等，已成为造成家禽呼吸道和产蛋下降的主要病原之一。在国内，郭龙宗等在胶东地区对种鸡群进行血清学检测，发现禽偏肺病毒感染是普遍存在的，多个鸡群的血清学阳性率达100%[9]。肉种鸡在开产前或30周龄左右极其易感，刘东等[10]对江苏、辽宁、河南、山东、河北等的101个鸡场进行调查，其中96个鸡场的发病鸡在150日龄～300日龄。陈琳等[11]将纯化的B亚型aMPV重组G蛋白作为诊断抗原，建立了检测B亚型aMPV抗体的间接ELISA检测方法，结果显示肉种鸡的阳性率为最高，商品蛋鸡阳性率最低。但血清学方法仅能检测出鸡群的抗体水平，无法检测鸡群带毒情况；病毒分离方法所需试验周期较长，且病毒分离较困难；而分子生物学方法操作简便，结果直观，敏感性高，特异性强，重复性好等优点已成为动物病原检测的重要方法[12-13]。F蛋白是禽偏肺病毒的主要表面抗原蛋白，在免疫选择压力下易产生抗原漂变[14]，所以本试验参照GenBank已公布的B亚型禽偏肺病毒F基因相对保守的片段设计引物，建立了RT-PCR方法，并对我国部分地区aMPV展开分子流行病学调查，旨在分析目前我国aMPV的流行状况并建立防控措施。

应用RT-PCR方法，对江苏、辽宁、河南、山东、河北等地区的种鸡群采取的鼻甲骨和鼻黏液进行检测，结果鸡群中aMPV阳性感染率达50.7%，表明aMPV在我国部分地区的商品鸡群中普遍感染，肉种鸡比蛋鸡更易感，产蛋期蛋鸡阳性率7.5%，肉种鸡高达88%。随机挑取9个阳性样品进行测序分析，结果均为B亚型禽偏肺病毒，与国内B型代表株之间的核苷核序列同源性为99.4%～99.9%，这与文献报道相一致[15]，而与欧洲代表株核苷核序列同源性为97.6%～97.9%。同时有报道称在近20多年间分离自欧洲的B亚型aMPV的F蛋白(与其相对应的基因)在B型病毒株之间的同源性大于98%，表明该蛋白的变异幅度非常小[16]， 而本文中的9个毒株，F基因变异幅度也比较小。

在国外，对于该病的发生除加强管理外，疫苗免疫也是主要防控手段，现已研制出B亚型弱毒苗VCO3株用于保护火鸡或鸡免受aMPV的感染[17]，但国内尚无商品化aMPV活苗、灭活疫苗、亚单位疫苗基因工程疫苗可用，因此，研究生产针对国内流行毒株的疫苗迫在眉睫。

[1]Sun S,Chen F,Cao S,et al.Isolation and characterization of a subtype C avian metapneumovirus circulating in Muscovy ducks in China[J].Vet Res,2014,45:74.

[2]Naylor C,J Brown,Edworthy P A,et al.Development of a reverse-genetics system for avian pneumovirus demonstrates that the small hydrophobic (SH) and attachment (G) genes are not essential for virus viability[J].J Gen Virol,2004,85(11):3219-3227.

[3]Salf Y M.禽病学[M].12 版.苏敬良,高福,等,译.北京:中国农业出版社,2012:355-365.

[4]Broor S,P Bharaj.Avian and human metapneumovirus[J].Ann N Y Acad Sci,2007,1102:66-85.

[5]沈瑞忠,曲立新,于康震,等.禽肺病毒的分离鉴定[J].中国预防兽医学报,1999,21(1):76-77.

[6]Cook J K,Chesher J,Orthel F,et al.Avian pneumovirus infection of laying hens: experimental studies[J].Avian Pathol,2000,29(6):545-556.

[7]Rivera-Benitez J F,Martinez-Bautista R,Rios-Cambre F,et al.Molecular detection and isolation of avian metapneumovirus in Mexico[J].Avian Pathol,2014,43(3):217-223.

[8]Abdel-Azeem A A,Franzo G,Dalle Zotte A,et al.First evidence of avian metapneumovirus subtype A infection in turkeys in Egypt[J].Trop Anim Health Prod,2014,46(6):1093-1097.

[9]郭龙宗,曲立新.禽肺病毒对种鸡感染的血清学调查[J].家禽科学,2009(2):34-36.

[10]刘东,杜元钊,李彬,等.肉种鸡肿头综合症的调查报告及防制措施[J].中国家禽,2011,33(10):45-46.

[11]陈琳,刁有祥,邹金峰,等.B亚型禽偏肺病毒重组G蛋白间接ELISA方法的建立及应用[J].中国兽医学报,2013,33(3):330-335.

[12]王艳,庄金秋,梅建国,等.禽偏肺病毒检测方法研究进展[J].动物医学进展,2015,36(6):130-134.

[13]谢志勤,谢芝勋,刘加波,等.禽肺炎病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立[J].动物医学进展,2014,35(10):1-6.

[14]Madbouly H M,Ahmed S S M,Hussein T,et al.Immunomodular effect of fusion gene DNA vaccine of avian metapneumoviruses[J].J Appl Poul Res,2014,23(3)::478-485.

[15]陈琳,刁有祥,邹金峰,等.禽偏肺病毒RT-PCR检测方法的建立及应用[J].中国兽医学报,2012,32(7):971-974.

[16]薛聪,唐熠,陈琳,等.1株B亚型禽偏肺病毒的分离与鉴定[J].中国兽医学报,2014,34(1):39-44.

[17]Cecchinato M,Catelli E,Lupini C,et al.Reversion to virulence of a subtype B avian metapneumovirus vaccine:is it time for regulators to require availability of vaccine progenitors[J].Vaccine,2014,32(36):4660-4664.

Molecular Epidemiology Analysis of aMPV in Some Regions in China during 2012 to 2015

ZHU Yan-mei,GONG Xiao,GUO Wei-wei,XU Bao-juan,LI Lu-mei,LANG Feng,LIU Hong-xiang,LIU Dong,FAN Gen-cheng

(StateKeyLaboratoryofAnimalGeneticEngineeringVaccine/QingdaoYebioBiologicalEngineeringCo.,Ltd.,Qingdao,Shandong,266114,China)

To investigate the molecular epidemiology of aMPV in China,turbinate and nasal mucus of hen flocks with swollen head symptoms were collected from Jiangsu,Liaoning,Henan,Shandong and Hebei and tested by RT-PCR.9 PCR positive products were randomly selected,and the sequence and genetic evolution of F gene were analyzed.The results indicated that 142 of 280 samples were positive and the positive rate was 50.7%.The F gene homology was 99.4% to 100% among 9 samples,and that the homology of the B type aMPV strains was 97.7% to 99.9%;whereas the homologies of the A type,C type and D type were 71.9% to 79.4%. Moreover, the analysis of phylogenetic tree showed that all 9 tested strains belong to B genotype.In conclusion,there are current aMPV infections in broiler flocks in China,and the B strain is the dominant genotype.This study provided the basis for the development of aMPV vaccine.

Avian metapneumovirus;epidemiology;F gene;homology

2016-03-01

朱艳梅(1985-)，女，河南商丘人，兽医师，硕士，主要从事动物传染病分子生物学研究。*通讯作者

S858.31;S852.659.5

A

1007-5038(2016)10-0030-05