2014年—2015年天津地区PRRSV分子流行病学调查及流行毒株的分离鉴定

孙英峰，李　志，路　超，韩　伟，任卫科，李富强，田向学，张　莉，李秀丽，付永利，于海霞，张立新，张　超，杨汉春

(1.中国农业大学动物医学院，北京 100094；2.天津市畜牧兽医研究所，天津 300384；3.天津市畜牧总站，天津 300402；4.石家庄市兽用生物制品供应站，河北石家庄 050000)



2014年—2015年天津地区PRRSV分子流行病学调查及流行毒株的分离鉴定

孙英峰1,2，李志3，路超2，韩伟2，任卫科2，李富强2，田向学2，张莉2，李秀丽2，付永利3，于海霞3，张立新3，张超4，杨汉春1*

(1.中国农业大学动物医学院，北京 100094；2.天津市畜牧兽医研究所，天津 300384；3.天津市畜牧总站，天津 300402；4.石家庄市兽用生物制品供应站，河北石家庄 050000)

为了解天津地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)流行毒株的遗传变异情况和流行趋势，用RT-PCR对2014年—2015年在天津地区采集的疑似PRRS病料检测，并扩增阳性病料PRRSV NPS2部分基因片段和进行PRRSV分离鉴定。结果显示，237份疑似PRRSV感染病料中64份为阳性，阳性率为27%，分离获得33株PRRSV；Nsp2序列分析发现，天津地区流行的PRRSV主要为美洲型，其中54份与高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)高度同源，8份与经典PRRSV高度同源，2份与NADC30-like高度同源。结果表明，2014年—2015年天津地区主要流行HP-PRRSV，并出现了NADC30-like变异毒株，说明PRRSV流行种类的多样化，提示加强 PRRSV流行及变异监测十分必要。

猪繁殖与呼吸综合征病毒；分离；分子流行病学；遗传演化分析

猪繁殖与呼吸综合征(俗称猪蓝耳病)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)引起的一种猪的烈性传染病，临床主要表现为母猪流产、死胎或者生长育肥各阶段猪群呼吸道症状[1-3]。该病1987年首次在美国发现，其后在世界各国均有发生；我国于1996年首次报道该病毒存在，随后流行于全国各地养猪场[4]。2006年以来，我国暴发了高致病性PRRS(highly-pathogenic PRRS，HP-PRRS)，给我国养猪业造成了巨大的经济损失[5]。

PRRSV是有囊膜的单股正链RNA病毒，基因组约15 kb，有9个开放阅读框(ORF1a、1b、2a、2b、3、4、5、6和 7)。ORF1编码病毒复制酶，该酶进一步裂解成12种非结构蛋白(Nsp)，其中Nsp2变异性最大，已有大量文献以此为流行病毒遗传演化及基因分型的相关报道[6-7]。近年来，PRRSV新变异毒株不断出现，尤其是传入我国的NADC30 PRRSV毒株，经遗传变异为NADC30-like PRRSV新毒株，已经在我国河南、河北、山西、四川、广西、广东等地区流行[8-9]。为系统分析天津地区PRRSV流行株基因变异情况和分子流行病学特点，本课题组先后对2014年—2015年发病猪场疑似PRRS病料收集、整理，并对237份病料检测及病毒分离，以期进一步为本地区PRRSV防控提供数据支撑。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1病料样品采集天津市宁河区、宝坻区、蓟县、西青区、武清区、静海区、津南区等地共237份疑似PRRSV感染病猪的脾脏、肺脏、淋巴结等器官。

1.1.2主要试剂Trizol Reagent,Invitrogen公司产品；DEPC,Amresco公司产品；新生胎牛血清、MEM,GIBCO公司产品；pMD-18T载体、dNTP、Trizol、RNase Inhibitor、M-MLV、Taq酶等,宝生物工程(大连)有限公司产品；DNA凝胶回收试剂盒,Omega公司产品；琼脂糖,Sigma公司产品；Marc145细胞,天津市畜牧兽医研究所实验室保存。

1.2方法

1.2.1病毒分离与鉴定将采集病料用无菌PBS清洗后取小块剪碎，用MEM 培养基进行1∶5倍稀释，加入双抗将病料进行研磨，反复冻融2次后，3 000 r/min离心15 min，取上清液用 0.22 μm滤膜进行过滤。待Marc-145细胞长成单层后，接种到96孔细胞培养板，37℃吸附1.5 h后，弃掉上清液，加入细胞维持液，放置37℃、体积分数为5%的CO2培养箱中培养，每天观察记录细胞病变(CPE)情况，将有细胞病变的毒株传3代～4代后用RT-PCR检测(ORF5基因)[10]。

1.2.2Nsp2基因RT-PCR扩增利用Trizol reagent说明书进行操作，提取病毒或病料总RNA，按反转录试剂盒说明书进行反转录。参考NADC30-like PRRSV毒株基因序列，利用DNA Star软件设计针对Nsp2高变区特异性引物(如读者需要作者可提供)。PCR反应条件：95℃ 5 min；94℃40 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，共30个循环；最后72 ℃ 10 min。

1.2.3PCR产物克隆与测序将PCR检测为阳性病料或毒株，分别扩增Nsp2基因，20 g/L琼脂糖电泳，切胶回收试剂盒纯化，克隆到pMD18-T载体，然后转化JM109感受态细胞，挑取阳性菌落，摇菌、PCR鉴定后送宝生物工程(大连)有限公司测序。

1.2.4序列分析用DNA Star软件对PRRSV 天津流行毒株及参考毒株(表1)的 Nsp2基因进行遗传进化比和同源性分析，并绘制基因进化树。

2　结果

2.1病毒的分离与鉴定

将RT-PCR检测为阳性临床样品接种Marc-145细胞，盲传3代观察CPE。部分样品在第3代时细胞发生聚堆现象，呈现出葡萄串状聚变，随后发生细胞皱缩、灶状脱落，最后出现空泡现象(图1)，通过RT-PCR可扩增出PRRSV的ORF5基因(预期片段682 bp)。结果在64份阳性病料中共分离到33株PRRSV(图2)。

A.正常细胞对照；B.分离株引起的Marc-145细胞CPE

A.Normal Marc-145 cells；B.CPE of infected Marc-145 cells

图1PRRSV分离株引起的Marc-145细胞病变

Fig.1CPE of Marc-145 cells infected with isolated stain

2.2临床样品RT-PCR检测结果

对2014年—2015年采自天津发病猪场237份疑似PRRSV感染病料进行RT-PCR检测，结果64份样品检出PRRSV的ORF5基因(预期片段682 bp)，阳性率为27%(图3)。

M.DNA 标准DL 2 000;1～7.临床分离毒株

M.DNA Marker DL 2 000;1-7.Isolated strains

图2部分PRRSV细胞分离毒株RT-PCR鉴定结果

Fig.2RT-PCR results of partial isolated strains

2.3Nsp2基因RT-PCR扩增结果

对本次试验中64份阳性样本，按照Trizol regent RNA提取试剂盒方法，提取RNA并进行Nsp2基因RT-PCR扩增，扩增产物切胶纯化回收后，克隆到pMD-18T载体，挑取并筛选阳性菌落，经鉴定阳性后送公司测序，Nsp2扩增片段长度为623 bp～1 016 bp(图4)。

M.DNA 标准DL 2 000;1～12,14～21.临床疑似PRRSV感染病料；13.阳性对照；22.空白对照

M.DNA Marker DL 2 000;1-12,14-21.Clinical samples；13.Positive control;22.Negative control

图3部分疑似PRRSV感染病料RT-PCR检测结果

Fig.3RT-PCR results of partial clinical samples

M.DNA 标准DL 2 000;1～18.部分阳性样品

M.DNA Marker DL 2 000;1-18.Partial positive samples

图4部分阳性样品Nsp2基因RT-PCR扩增结果

Fig.4Amplification of Nsp2 gene of positive samples by RT-PCR

2.4Nsp2基因的核苷酸序列分析

对测序结果比较分析显示，64株毒株之间Nsp2序列同源性为65.4%～98.5%,与美洲型毒株HP-PRRSV(JXA1毒株)的Nsp2序列同源性为60.4%～99.6%,与欧洲毒株(LV毒株)的Nsp2序列同源性为41.3%～44%，表明这些毒株均属于美洲型，其中54株与以JXA1、HuN4、TJ等为代表的HP-PRRSV高度同源，序列相似度为96.5%～99.3%；8株与以VR2332为代表经典毒株高度同源，序列相似度为98.7%～99.6%；2株与NADC30、MN184C等毒株高度相似，序列相似度为90.5%～95.1%，与HP-PRRSV及经典PRRSV均相差较远，其缺失部位和数量也有所不同，在975-1307、1452-1454、1515-1571、1758-1763位共缺失396个核苷酸外，与周峰等[11]、Zhao K等[12]、Zhou L等[11]报道缺失393个核苷酸不同，还多缺失6个核苷酸。

2.5Nsp2基因推导的氨基酸同源性分析

通过软件分析，天津地区64株PRRSV Nsp2基因所推导氨基酸序列之间的同源性为59.5%～98.4%，其中54株与以JXA1、HuN4、TJ等为代表HP-PRRSV高度同源，氨基酸相似度为87.5%～99.1%；8株与以VR2332为代表经典毒株氨基酸相似度为97.3%～99.4%；而2株与HP-PRRSV和经典PRRSV均存在明显差异，与NADC30毒株同源性较高，相似度为89.3%～92.7%，且本次试验中2毒株的氨基酸缺失部位和数量与HP-PRRSV或其他变异毒株有很大不同，在323-433、482、501-519、581-582位共缺失133个氨基酸，与周峰等[11]、Zhao K等[12]、Zhou L等[11]报道缺失131个氨基酸不同，还多缺失2个氨基酸。

2.6基于Nsp2部分序列的PRRSV遗传进化分析

利用软件，绘制基于Nsp2部分序列的PRRSV遗传进化树(图5)，由图可以看出，美洲型PRRSV可分为3个亚群，即亚群1是以JXA1、HuN4、TJ等为代表HP-PRRSV分支，亚群2是以VR2332为代表的经典毒分支，亚群3是以NADC30、MN184C等为代表分支。本研究中64株天津地区PRRSV毒株中有54株属于亚群1，8株属于亚群2，另外2株则属于亚群3。由此可见，近两年天津地区流行的PRRSV仍以HP-PRRSV为主，在有经典毒株存在的同时，又不断有新的NADC30-like变异毒株出现。

其中TJJX-1、TJNH-1等代表毒株位于亚群1，为主要流行毒株；TJXQ-1，TJBD-1等代表毒株位亚群2；TJJH-1，TJNH-3位于亚群3，属于NADC30-like PRRSV流行毒株

The representative strains TJJX-1,TJNH-1,as the main epidemic strains are located in subgroup 1；The representative strains TJXQ-1，TJBD-1 are located in subgroup 2；TJJH-1，TJNH are located in subgroup 3，belonging to NADC30-like PRRSV

图5基于天津地区部分PRRSV临床分离毒株和参考株Nsp2基因核苷酸序列的遗传演化分析

Fig.5Phylogenetic tree of PRRSV epidemic isolates and reference stains based on their Nsp2 nucleotide sequences

3　讨论

2006年5月，由PRRSV变异毒株引起的“高热病”造成养猪场猪群大量死亡，已成为危害我国养猪业的主要疾病之一。本次研究针对天津地区发病猪场疑似PRRSV感染病料进行Nsp2基因检测，结果表明，天津地区流行的PRRSV仍以HP-PRRSV为主，在有经典毒株存在的同时，又有新的NADC30-like PRRSV变异毒株出现，且这些新变异毒株均分离自种猪场，其流行很可能与引种有关[11-13]，但具体来源有待进一步研究。

目前，PRRSV主要分为2个基因型，分别为以VR2332毒株为代表的美洲型和以LV为代表的欧洲型[14-15]，其中Nsp2在同一基因型中和各基因型之间变异都很大，因此，Nsp2可用于对PRRSV进行分子流行病学分析。本研究通过对2014年—2015年天津地区PRRSV的Nsp2基因核苷酸与氨基酸同源性及遗传进化分析，结果发现54株位于在基因进化树中亚群1中，这些流行毒株可能为疫苗株或由HP-PRRSV演化出来毒株；8株在进化树中均位于经典毒株VR2332为代表的亚群2中，且近两年临床检出率呈增高趋势，提示天津地区猪群中存在不断进化的经典PRRSV；2株在进化树中均位于NADC30毒株为代表的亚群3中，且同时分离出HP-PRRSV(图1中17号样品)，Nsp2基因与相关报道存在393核苷酸缺失不同，还多存在6核苷酸缺失，共有399核苷酸缺失，这些足以说明该类病毒正处于与国内其他流行株不断遗传重组进化过程中，该类新的NADC30-like PRRSV变异毒株未来如何演变进化，临床致病性如何发展等问题均值得高度关注，因此，有必要对其流行情况及基因进化进行实时监测分析。

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�比对和遗传进化分析参考毒株 Table 1The

毒株Strains分离地及时间Originandtime登录号Accessionnumber毒株Strains分离地及时间Originandtime登录号AccessionnumberCH-1aChina,2001AY03262BJ-4China,2001AF331831S1China,2007DQ459471HEB1China,2007EF112447HuN4China,2007EF635006JXA1China,2007EF112445VR2332USA,2008EF536003Haakeye2-BeforeUSA,2008EF532811WUH4China,2011JQ326271TJChina,2012EU860248LVNetherland,1993M96262NADC30USA,2008JN65459HENAN-HEBChina,2014KJ143621MN184CUSA,2008EF488739HENAN-XINXChina,2014KF611905CHsx1401China,2015KP861625

Isolation,Identification and Molecular Epidemiology of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus in Tianjin from 2014 to 2015

SUN Ying-feng1,2，LI Zhi3，LU Chao2，HAN Wei2，REN Wei-ke2，LI Fu-qiang2，TIAN Xiang-xue2，ZHANG Li2，LI Xiu-li2，FU Yong-li3，YU Hai-xia3，ZHANG Li-xin3，ZHANG Chao4，YANG Han-chun1

(1.CollegeofVeterinaryMedicine，ChinaAgriculturalUniversity，Beijing,100094，China；2.InstituteofAnimalScienceandVeterinaryMedicine，Tianjin,300112，China；3.TianjinAnimalHusbandryStation，Tianjin,300402，China；4.ShijiazhuangAnimalBiologicalProductsManagement，Shijiazhuang，Hebei,050000，China)

This study aimed at analyzing the genetic variation and the development trend of PRRSV in Tianjin from 2014 to 2015.237clinical samples collected from 2014 to 2015 in different districts of Tianjin were tested by RT-PCR to amplify partial Nsp2 and isolate virus using positive samples.The result showed that 64 samples were positive，the positive rate was 27%，and acquired 33 PRRSV isolates were field;partial Nsp2 gene and phylogenetic analysis revealed that most of pandemic strains were the North American prototype，and 54 samples were highly homologous with the highly pathogenic PRRSV(HP-PRRSV)，8 samples were highly homologous with classic PRRSV，2 samples were highly homologous with North American pandemic strain NADC30. The study indicated that HP-PRRSV was the popular strain in Tianjin during 2014-2015，the NADC30-like PRRSV emerged make the category of PRRSV variant more diverse，pointing that it is important to pay more attention to monitor prevalent and genetic variation of PRRSV.

Porcine reproductive and respiratory syndrome virus；isolation；molecular epidemiology；phylogenetic analysis

2016-03-16

孙英峰(1979-)，男，山东新泰人，副研究员，主要从事动物疫病分子流行病学研究。*通讯作者

S852.659.6

A

1007-5038(2016)10-0011-05