艰难梭菌毒素A/B、BD-PCR毒素基因及GDH检测对艰难梭菌相关性腹泻的诊断价值

邵 婧，丁 宸，徐萍萍

（徐州市中心医院检验科，徐州221009）

艰难梭菌毒素A/B、BD-PCR毒素基因及GDH检测对艰难梭菌相关性腹泻的诊断价值

邵 婧，丁 宸，徐萍萍

（徐州市中心医院检验科，徐州221009）

目的 探讨艰难梭菌毒素A/B及其相关毒素基因检测对艰难梭菌相关性腹泻的诊断价值。方法 收集2015年1月至2015年10月我院ICU病房腹泻疑似艰难梭菌感染患者的粪便标本133例作为研究对象，分别采用艰难梭菌培养法、CDAB法、PCR毒素基因检测法及艰难梭菌毒素GDH检测法进行检测，以艰难梭菌培养法结果为金标准，计算各方法的诊断指标所包含有的特异度、敏感度、阴性预测值和阳性预测值等。结果 本研究收集的133例粪便标本中，经过金标准粪便样本厌氧培养法检出阳性结果20例，阴性结果113例。CDAB法具有低敏感度（0.550）和高特异度（0.912），诊断符合率为0.932，BD-PCR毒素基因检测法具有高敏感度（0.950）和高特异度（0.929），诊断符合率为0.932，艰难梭菌毒素GDH检测法的高敏感度（0.900）和低特异度（0.779），诊断符合率为0.797。结论 对于疑似艰难梭菌感染，可联合艰难梭菌GDH、艰难梭菌毒素A/B（CDAB）或进行荧光定量PCR毒素基因共同检测，有效降低检测时间，为临床医师及时提供准确的诊断依据，并制定行之有效的治疗措施。

艰难梭菌毒素A/B； 毒素基因； 灵敏度； 诊断价值

艰难梭菌是一种厌氧性细菌，是引起抗菌药物相关腹泻及假膜性结肠炎的主要原因［1］。近年来，在医院引发的艰难梭菌感染逐渐被人重视，早期艰难梭菌相关性腹泻快速准确的诊断对于有效预防及治疗医院微生物感染非常重要［2］。检测艰难梭菌的金标准方法为细菌培养和细胞培养毒素实验，其检测条件较为苛刻，需专业性厌氧培养箱和组织培养条件，且操作复杂，检测周期长，难以在临床推广和普及［3］。为了探讨艰难梭菌毒素A/B及其相关毒素基因检测对艰难梭菌相关性腹泻的诊断价值，本文以粪便样本厌氧培养法为金标准，选取2015年1月至2015年10月我院ICU病房133例腹泻患者的粪便标本，采用不用的检测方法进行研究，现将结果报道如下。

材料和方法

1 标本来源

收集2015年1月至2015年10月我院ICU病房腹泻疑似艰难梭菌感染患者的粪便标本133例，其中65岁以上56例，50至65岁之间患者43例，50岁以下患者34例。纳入标准：患者在24h内出现3次或3次以上腹泻；粪便性状为稀便、糊状便或水样便；腹泻前3个月内使用过抗生素。首先采集腹泻患者的粪便作为检测标本，并将标本置于干净无防腐剂的无菌杯中，在2～8℃环境中保存，24 h内检测。每例患者留取2份标本，一份进行厌氧培养，另一份进行艰难梭菌GDH、艰难梭菌毒素A/B（CDAB）、荧光定量PCR毒素基因检测。

2 试剂和仪器

细菌培养所需的厌氧培养基、厌氧产气剂、ANC鉴定卡以及细菌鉴定仪VITEK2等购买于法国生物梅里埃公司；采用酶联荧光测定法（ELFA）检测艰难梭菌毒素A/B（CDAB），CDAB检测试剂盒及VIDAS分析仪均来自法国生物梅里埃公司；采用PCR法检测CDAB毒素基因，检测试剂盒购买于美国BD公司，PCR扩增仪型号为ABI 9700型（美国）。

3 方法

对所有标本进行编号，同时进行艰难梭菌毒素A/B（CDAB）检测、艰难梭菌培养、艰难梭菌毒素GDH及PCR毒素基因检测。

3.1艰难梭菌培养 挑取适量粪便标本于肉汤中充分震荡混匀后接种于厌氧培养基和艰难梭菌选择性培养基（CCFA），于35℃厌氧环境持续培养5d，每天都对菌落生长情况进行仔细观察，根据艰难梭菌菌落形态以及革兰染色镜下典型形态进行鉴别，使用梅里埃ANC鉴定卡进行鉴定。

3.2艰难梭菌毒素A/B（CDAB）检测 采用两步夹心法与终点荧光检测相结合的酶联免疫荧光法技术（ELFA）。取均一化的粪便标本200μL于1000μL样本稀释液中充分混匀，离心时间设置为5min。每个CDAB SPR与CDAB试剂条对应每份质控品与标本。将300μL标本上清液加入标本孔中，于固相管（SPR）内外数次循环反应液，每步反应后开始对循环进行清洗有利于未结合成分的去除。在4个检测步骤自动完成后，仪器自动分析结果。结果判读：按照试剂盒说明书，检测值＜0.3，为阴性结果；0.13～0.37，为可疑阳性；≥0.37，为阳性结果。

3.3BD-PCR毒素基因检测［4］采用实时定量PCR仪（美国ABI 9700），BD Gene Ohm实时荧光定量PCR检测试剂盒购买自美国BD公司。将较多的样本蘸取于无菌干棉棒上，并悬于样本缓冲液中进行充分混合，然后取10μL加入至裂解缓冲液中进行核酸的提取。将试剂混合物（包含内质特异性探针与毒素B基因）与裂解液（3μL）混合加入至专用的试管中，并使用PCR扩增仪完成DNA扩增，在每次扩增过程中，均包含阳性与阴性质控。对于扩增的DNA靶序列，分别使用针对性的分子信标进行标记。

3.4艰难梭菌毒素GDH检测［5］艰难梭菌毒素GDH采用胶体金法检测，检测卡由德国Nadal公司提供。检测前，先用稀释液对粪便样品进行稀释，再加入4滴粪便稀释液于检测卡上，若样本中含有GDH，检测卡会显示出红色。

4 统计学处理

检测结果用SPSS20.0软件进行分析处理。以艰难梭菌培养法为判定艰难梭菌感染的金标准，计算各方法的特异度、敏感度、阴性预测值和阳性预测值等诊断指标。

结果

1 三种检测方法与金标准检测结果

本研究收集的133例粪便标本中，经过金标准粪便样本厌氧培养法检出阳性结果40例，阴性结果93例；CDAB检测阳性样品为21例，阴性样品为112例；PCR方法检测阳性样品为27例，阴性样品为106例（图1）；GDH方法检测阳性样品为43例，阴性样品为90例（图2）。结果见表1。

表1　CDAB，PCR及GDH检测与金标准检测结果的比较

2 三种检测方法结果诊断学指标

PCR毒素基因方法在敏感性、特异性方面显著优于CDAB和艰难梭菌毒素GDH（P＜0.001），在诊断符合率方面CDAB和PCR毒素基因均显著优于艰难梭菌毒素GDH（P＜0.05），结果见表2。

表2　三种检测方法结果诊断学指标的比较

讨论

临床上抗生素相关腹泻与艰难梭菌紧密相关，该细菌感染具有非特异性表现，病情较轻时仅为自限性腹泻，严重情况下可出现中毒性巨结肠与伪膜性肠炎［6］。全球流行病学研究结果表明，艰难梭菌感染发病率、复发率、病死率（尤其在北美与欧洲）呈急剧上升趋势［7］。另外，该疾病在社区也具有较高的发病率。然而，由于缺乏较好的诊断方法，使得目前艰难梭菌感染的诊断特异性差、敏感性低、周期长，且要求技术也较高［8］。

艰难梭菌是一种严格的专性厌氧菌，用实验室常规的厌氧培养法非常困难。现有的检测艰难梭菌的方法有、厌氧培养法、酶联免疫法、PCR检测及GDH检测等。其中组织培养细胞毒素试验和粪便标本厌氧培养是检测艰难梭菌的金标准，但这两种检测方法花费时间长，经济成本大，同时操作复杂，难以在临床应用中推广［9］。PCR检测法具有较高的特异度与灵敏度，同时花费时间短，简单易操作，唯一缺点是经济成本较大。GDH检测是近年来检测艰难梭菌的一种新方法，其敏感度较高，操作快捷简单。酶联免疫检测方法是目前比较成熟且应用较为广泛的检测方法，不仅操作简洁，成本较低，可与GDH检测联合应用［10］。

本文133例腹泻患者中有20例粪便标本检出艰难梭菌，阳性率15.0%（20/133）。本文研究结果表明相比于金标准艰难梭菌培养法，酶免疫学法CDAB法虽然具有高特异度（0.912），具但敏感度（0.550）较低，因此酶免疫法不宜单独用于临床检测艰难梭菌。艰难梭菌毒素GDH检测法虽具有高敏感度（0.900），但特异度较低（0.779），可与酶免疫学法CDAB联合使用。其中BD-PCR毒素基因检测法效果最佳，具有高敏感度（0.950）和高特异度（0.929）。

综上所述，疑似艰难梭菌相关性腹泻患者在没有培养出致病菌的情况下，可采用多个实验技术相结合的方法，先检测艰难梭菌GDH，用于细菌定植筛查GDH。再检测艰难梭菌毒素A/B（CDAB）或进行荧光定量PCR毒素基因检测，用于毒素确认诊断。以上方法可大大降低检测时间，为临床医师及时提供准确的诊断依据，并制定行之有效的治疗措施。同时能及时报告艰难梭菌院内爆发，促进感控措施，减轻患者痛苦，降低死亡率。

［1］严其容，李文革，许文荣，等.25株艰难梭菌多位点序列分型.临床检验杂志，2012，30（3）：183-186.

［2］姜国俊，王学艳，张曼，等.腹泻型肠易激综合征患者食物特异性IgG抗体的检测及意义.标记免疫分析与临床，2008，15（6）：402-403.

［3］张春莹，康梅，何超，等.艰难梭菌腹泻及实验室诊断.寄生虫病与感染性疾病，2012，10（2）：68-72.

［4］周丽民，雷永良，王小光，等.实时荧光定量 PCR技术在致病菌检测中的应用.标记免疫分析与临床，2012，19（5）：296-299.

［5］刘元元，刘文恩，简子娟，等.住院腹泻患者艰难梭菌检测与分析.中国感染控制杂志，2012，11（4）：293-296，299.

［6］吴微珍.艰难梭菌实验室检测方法的比较.浙江大学，2012：31-32.

［7］孙立颖，黄磊，严岩，等.酶联荧光免疫分析技术检测粪便中艰难梭菌毒素A/B.临床检验杂志，2012，30（2）：95-97.

［8］杨雪妹，吴允孚.艰难梭菌的生物学特性与实验室诊断.中国感染与化疗杂志，2013，13（3）：232-234.

［9］Gallegos-Orozco J F，Paskvan-Gawryletz C D，Guradu S R，et al. Successful colonoscopic fecal transplant for severe acute clostridium difficile pseudomembranous colitis.Rev Gastroenterol Mex，2012，77（1）：40-42.

［10］唐海先，肖洪广，杨玉静，等.腹泻患者艰难梭菌的检测及分析.中国卫生检验杂志，2013，23（17）：3328-3231.

（潘子昂编辑）

Detection of Clostridium Botulinum Toxin A/B，BD-PCR Toxin Gene and GDH in the Diagnosis of Clostridium Botulinum Associated Diarrhea

SHAO Jing，DING Chen，XU Ping-ping
（Department of Clinical Laboratory，Central Hospital of Xuzhou，Xuzhou 221009，China）

Objective To study the diagnostic value of Clostridium Botulinum toxin A/B and its associated toxin gene in the diagnosis of Clostridium Botulinum associated diarrhea.Methods A total of 133 patients with diarrhea stool specimens suspected having Clostridium difficile infection were selected as the research objects.Clostridium difficile culture method for stool specimens，Clostridium difficile toxin A/B（CDAB），PCR toxin gene detection，and Clostridium difficile toxin GDH detection were used for the study.We took Clostridium difficile culture as a gold standard and calculated sensitivity，specificity，positive/negative predictive value for each method.Results Out of 133 cases stool specimens，20 cases were positive for Clostridium difficile infection，113 cases were negative based on the gold standard of stool samples anaerobic culture.The CDAB method had low sensitivity（0.550）and high specificity（0.912），the diagnostic accordance rate was 0.932.BD-PCR toxin gene detection method had high sensitivity（0.950）and high specificity（0.929），the diagnostic accordance rate was 0.932.Clostridium difficile toxin GDH detection method had high-sensitivity sense（0.900）and low specificity（0.779），diagnostic coincidence rate was 0.797.Conclusion Clostridium difficile GDH can be combined with Clostridium difficile toxin A/B（CDAB）or PCR toxin gene detection for suspected Clostridium difficile infection.It can effectively reduce the detection time，provide accurate diagnosis for clinicians in order to develop effective treatment measures.

Clostridium botulinum toxin A/B； Toxin Gene； Sensitivity； Diagnostic value

10.11748/bjmy.issn.1006-1703.2016.09.013

2016-03-27；

2016-04-14

徐萍萍。