基于磁珠的胃蛋白酶原Ⅰ和Ⅱ双标记时间分辨荧光免疫分析试剂的研制

林颜玉， 任志奇，刘天才， 吴英松

(1.南方医科大学生物技术学院，广东 广州 510515；2.中山古镇人民医院，广东 中山 528421)



基于磁珠的胃蛋白酶原Ⅰ和Ⅱ双标记时间分辨荧光免疫分析试剂的研制

林颜玉1,2， 任志奇1，刘天才1， 吴英松1

(1.南方医科大学生物技术学院，广东 广州 510515；2.中山古镇人民医院，广东 中山 528421)

磁珠；时间分辨荧光免疫分析法；胃蛋白酶原；胃癌

0 引言

胃癌是临床上最为常见的恶性肿瘤之一，该病患者的发病率和病死率呈现逐年上升的发展趋势[1].胃蛋白酶原是胃液中胃蛋白酶的无活性前体物质，根据其生化性质和免疫原性，将其分为 PGⅠ和PGⅡ2个亚群.PGⅠ主要由胃底腺的主细胞和黏液颈细胞分泌；PGⅡ除由胃底腺的主细胞和黏液颈细胞分泌外，贲门腺和胃窦幽门腺的黏液颈细胞以及十二指肠上段也能分泌[2].胃黏膜出现病变时，血清胃蛋白酶原含量会随之改变[3].研究发现，血清胃蛋白酶原(pepsinogen，PG)可作为胃癌和癌前病变高危人群的早期血清筛查指标[4-5].

胃癌治疗效果的好坏，取决于能否早期诊断、早期治疗.目前，胃癌诊断主要依靠胃镜及病理检查，早期血清学筛查尚未在临床普及.血清PG检测是一种非介入性、简便、快速、便于动态监测、重复性好的检查方法.临床上通常联合考察血清PGⅠ、PGⅡ、PGⅠ/PGⅡ比值(PGR)3个指标，将胃部有疾病的患者筛查出来，再通过胃镜、病理做进一步的确诊.目前常用的血清 PG 检测技术包括：酶联免疫吸附试验[6-7]、乳胶增强比浊法[8-9]、时间分辨荧光免疫分析法[10]及化学发光免疫分析法[11-12].

磁性纳米颗粒(magnetic microparticles，MMPs)是纳米粒子的一种，磁珠表面修饰各种功能化基团，如羟基、氨基、羧基及巯基等，可与含有相应抗原的靶物质特异性地结合形成磁珠-抗体复合物，然后通过外加磁场的作用，使磁珠和溶液快速分离，可以在短时间内将待测样品中的目标分子捕获富集，缩短反应和检测时间，提高检测灵敏度及检测效率[13-15].由于磁性微球代替其他固相载体用于免疫分离，不仅简单易行、特异性好、回收率高，还可将免疫分离与富集结合为一体，因此它在生物分子的分选和检测等诸多领域展现了广阔的研究与应用前景.

时间分辨荧光免疫分析技术(timed-resolved fluoroimmunoassay，TRFIA) 是以镧系稀土元素螯合物为示踪物，具有特异性荧光的超灵敏度检测技术，具有灵敏度高、特异性强、标记物制备简便、储存时间长、无放射性污染、检测重复性好、标准曲线范围宽和应用范围广泛、价廉等优点[16-17]，克服了放射免疫分析的同位素污染、半衰期短及酶免疫分析方法稳定性差等缺点，同时能够进行多种物质的联合检测[18]，广泛应用于生物医学研究和临床医学检验，被认为是最有发展前途的一项微量检测手段之一.

在本研究中，采用镧系稀土离子铕(Eu3+)和钐(Sm3+)作为荧光示踪剂，分别标记抗PGⅠ和PGⅡ抗体，结合时间分辨荧光免疫分析技术和磁珠分离技术，同时检测血清中PGⅠ/PGⅡ的含量，来自南方医院的61份临床样本，对其血清胃蛋白酶原水平进行检测，并对检测结果与南方医院化学发光试剂检测结果进行统计学分析，对试剂的各项性能指标进行评估，评价其在临床检测应用中的可行性.同时通过对105份胃病患者血样及200份健康人血样进行分析，探讨在胃癌及其他多种胃部变病诊断中PGⅠ、PGⅡ含量及PGR的意义.

1 材料和方法

1.1 材料和仪器 抗PGⅠ的配对抗体(ab50123，ab50607)和抗PGⅡ的配对抗体(ab88284，ab31467)购自英国Abcam公司；PGⅠ抗原标准品(440-01)和PGⅡ抗原标准品(A01420H)分别购自LEE Biosolutions公司和Meridian公司；牛血清白蛋白(Bull Serum Albumin，BSA)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)、吗啉乙磺酸钠盐(MES)购自美国Sigma-Aldrich公司；磁珠 (1101GA-03) 购自日本JSR Life Sciences公司；96孔微孔板为芬兰Labsystem公司产品；50 kD超滤离心管购自美国Millipore公司；铕标记试剂盒购自美国PerkinElmer公司；分子筛层析柱填料SephadexTM G-50购自美国GE Healthcare公司；荧光测量仪为PerkinElmer公司的Victor3 1420时间分辨免疫荧光检测仪.提供自广东省广州市京溪南方医院的105份胃病患者血样及200份健康人血样，以及61份临床考核样本血清原始PG数值由雅培化学发光试剂盒测定.

1.2 实验方法

1.2.1 抗体和磁珠的活化 抗体预处理：分别取0.1 mg 抗PGⅠ抗体(ab50123)或抗PGⅡ抗体(ab88284)加入50 kD超滤离心管中，4 ℃下9 000 r/min离心5 min.弃去滤液，加入300 μL 磁珠活化缓冲液(0.1 mol/L MES，pH 5.0)，重复5次.最后反转倒扣收集200 μL体积抗体，4 ℃保存.

磁珠预处理：取20 mg充分混匀的磁珠到离心管中，加入1 mL连接缓冲液，混匀后将离心管置于磁力架上约30 s至上清液澄清，移弃上清液，重复洗涤3次.然后加入磁珠表面基团羧基(—COOH)活化剂EDC(80 μL，10 mg/mL)和NHS(56 μL， 10 mg/mL)(现配现用)，混匀后置于垂直旋转混合仪上活化30 min，活化后再用连接缓冲液洗涤去除多余活化剂成分.

1.2.2 抗体与磁珠的偶联 根据特定条件下蛋白的稳定性和经NHS活化后的磁珠的反应活性，选择在弱碱性条件下进行两者的偶联反应.具体实验方法如下，将预处理的抗体(0.1 mg)和磁珠(10 mg)混合，补加磁珠蛋白连接缓冲液(0.1 mol/L MES，pH 7.4)至1 mL，置于垂直旋转混合仪上25 ℃孵育过夜(约18 h).连接过夜后用保存液TBST(0.025 mol/L Tris，0.15 mol/L NaCl，0.05% Tween-20，pH 7.4)洗涤免疫磁珠3次，去除多余的游离抗体.最后稀释磁珠浓度至0.5 mg/mL，4 ℃保存.

1.2.3 Eu3+/Sm3+标记抗体的制备 本研究采用稀土元素螯合物带有异硫氰酸基，为异硫氰酸苄基二亚乙基三胺四乙酸- Eu3+/Sm3+，这是一种双功能螯合试剂.在碱性条件下，异硫氰酸基在水溶液中与蛋白的自由氨基经碳酰氨化而形成硫脲键.具体实验方法如下，Eu3+/Sm3+分别连接经标记缓冲液(50 mmol/L Na2CO3，pH 9.0)处理的抗PGⅠ抗体(ab50607)及抗PGⅡ抗体(ab31467)各0.5 mg.按照PerkinElmer公司标记试剂盒说明书(标记1 mg抗体需要0.2 mg Eu3+标记试剂或0.5 mg Sm3+标记试剂)，加入0.1 mg 铕螯合物和0.25 mg 钐螯合物，将标记抗体和标记试剂充分混匀，最终反应总体积约200 μL，25 ℃振荡约18 h.次日过SephadexTM G-50凝胶层析柱纯化，同时收集流出液(1 mL/管)，然后逐管测定荧光信号值，合并峰管，加入10% 浓度的BSA至终浓度为0.1%，4 ℃保存.

1.3 磁珠时间分辨免疫分析反应模式 本实验采用双抗体夹心一步反应模式(图1)，往已封闭的96孔微孔板内加入25 μL标准品或待测样品，25 μL免疫磁珠，最后加入100 μL用反应缓冲液稀释的Eu3+/Sm3+标记抗体(抗- PGⅠ- Eu3+/ 抗- PGⅡ- Sm3+均1∶200稀释)，室温振荡孵育30 min后，形成磁珠-抗体-抗原-抗体-Eu3+/Sm3+.将96孔板置于磁力板上用洗涤液冲洗6次.最后加入100 μL增强液振荡5 min，用Victor3 1420时间分辨检测仪检测荧光值.

图1 PGⅠ/PGⅡ磁珠时间分辨荧光免疫分析反应模式

1.4 PGⅠ/PGⅡ-MMPs-TRFIA方法学评价 1)标准曲线的绘制：以自制试剂中参考标准品浓度(PGⅠ: 0、5、20、50、200、500 ng/mL; PGⅡ: 0、2、5、10、20、50 ng/mL)的对数为横坐标，信号值1×103计数的对数为纵坐标，由双对数数学模型Log-Log函数处理;2)分析灵敏度：以零参考标准品当作样品测量20次，计算其均值及标准差.以其测定值的均值加上2倍标准差所得信号值减去本底信号值，再代入标准曲线方程计算所得出的浓度.3)准确性实验：使用阴性血清将PGⅠ/PGⅡ抗原稀释作为样品，在自制试剂盒上测定，计算回收率；4)精密性：采用自制的低、中、高3个质控品(质控品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)进行测定，分析内精密度实验设10个复孔，分析间精密度实验设10次检查，计算各质控品检测值的均数、标准差及CV值.按照2000版生物制品检定规程，分析内CV<10%，分析间CV<20%；5)临床血样的分析：61份临床考核样本用自制试剂与与南方医院雅培化学发光检测提供结果进行相关性分析，应用统计软件SPSS13. 0进行数据分析.

2 结果

2.1 剂量-反应曲线 以自制试剂中参考标准品浓度(PGⅠ: 0、5、20、50、200、500 ng/mL; PGⅡ: 0、2、5、10、20、50 ng/mL)的对数为横坐标，信号值计数的对数为纵坐标，由双对数数学模型Log-Log函数处理，测得PGⅠ试剂剂量-反应曲线方程为：Y=3.71+0.93X，r2=0.999，P<0.0001(图2)； PGⅡ试剂剂量-反应曲线方程为：Y=3.05+0.80X，r2=0.999，P<0.000 1(图3)，表明自制试剂有良好的剂量反应.

图2 自制试剂PGⅠ剂量-反应曲

图3 自制试剂PGⅡ剂量-反应曲

表1 PGⅠ/PGⅡ时间分辨免疫荧光分析试剂准确度考核结果

2.5 临床血样分析及试剂的考核 61份临床考核样本采用自制试剂进行PGⅠ和PGⅡ同时检测，对所测数值与南方医院雅培化学发光试剂检测结果进行相关性分析，结果显示两种方法所得的数值相关性良好，PGⅠ：Y=2.45+1.03X，r2=0.958，P<0.000 1(图4)；PGⅡ：Y=1.61+1.08X，r2=0.988，P<0.000 1(图5).由此可以看出研制的PGⅠ/PGⅡ磁珠时间分辨荧光免分析试剂在性能指标及检测效能上与雅培的化学发光试剂盒无明显差异，有望将该分析试剂应用于临床胃癌及其他多种胃部疾病血清PGⅠ/PGⅡ标志物的检测.

表2 PGⅠ/PGⅡ双标记时间分辨免疫荧光分析试剂精密度实验

a平均值±标准差

图4 MMPs-TRFIA法与CLIA法血样PGⅠ 测试相关回归分

图5 MMPs-TRFIA法与CLIA法血样PGⅡ 测试相关回归分

表3 健康人与四组胃病患者的PGⅠ、PGⅡ和PGR水平对比

3 讨论

免疫磁珠是利用抗原抗体的高度特异性识别作用和磁载体技术相结合而发展起来的一类新型材料.由于磁性微球代替其他固相载体用于免疫分离，不仅简单易行、特异性好、回收率高，还可将免疫分离与富集结合为一体，因此它在生物分子的分选和检测等诸多领域展现了广阔的研究与应用前景.我们建立的血清胃蛋白酶原磁珠时间分辨荧光免疫分析方法，将磁性分离技术与时间分辨镧系稀土元素标记的高灵敏度相结合，在同一测试分析体系中，采用双标记技术同时检测，一次测量可以得到PGⅠ、 PGⅡ及 PGⅠ/PGⅡ比值3个结果，而CLIA只可分别测定，再进行PGⅠ/PGⅡ比值的计算，容易造成误差的积累.将磁珠代替传统的微孔板作为蛋白附着的载体具有以下的优点：1)通过共价键与捕获抗体连接，比聚苯乙烯为材料的微孔板的物理吸附作用更牢固；2)磁珠表面积更大，能结合更多的蛋白分子，相对板吸附大大减少抗体损耗；3)作为一种小型的、流动相载体，使反应能更快地达到动态平衡，从而加快反应速度；4)整合多种偶联有针对不同抗原的抗体的磁珠，使检测同一样本中不同的待测物成为可能.

血清胃蛋白酶原水平可反映胃黏膜变化，可作为胃癌高发区有症状慢性胃病患者慢性萎缩性胃炎和胃癌的重要筛查指标，同时也可应用于胃溃疡病的鉴别诊断[19].胃蛋白酶原检测作为一项无创性检测，用于胃癌癌前病变和胃癌的早期诊断及筛查，以及胃癌术后的随访监测，已得到普遍的认可，具有一定的实用性.

该研究建立的PGⅠ/PGⅡ磁珠时间分辨荧光双标记免疫分析试剂的各项指标包括准确性、剂量-反应曲线范围、灵敏度、精密性以及同进口试剂的相关性等均达到检测试剂预期的要求，可与国外价格高昂的同类试剂竞争，有望替代国内外同类试剂用于各种胃病的大规模普查筛选及患者病程的监测.同时结合磁性纳米颗粒的高效分离与富集作用及免疫分析方法的高灵敏度与快速检测的特点，为免疫学检验技术的发展带来了新的契机，极大地促进了免疫技术的发展与更新.

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(责任编辑 游俊)

Magnetic microparticles-based time-resolved fluoroimmunoassay for the simultaneous determination of pepsinogen Ⅰ and Ⅱ

LIN Yanyu1,2，REN Zhiqi1，LIU Tiancai1，WU Yingsong1

(1. School of Biotechnology，Southern Medical University，Guangzhou 510515，China;2. Zhongshan Guzhen People′s Hospital，Zhongshan 528421，China)

To develop a novel time-resolved fluoroimmunoassay (TRFIA)，in which magnetic microparticles were used as carriers，for detection of pepsinogenⅠ (PGⅠ) and pepsinogenⅡ (PGⅡ) in serums from patients with gastric cancer and other gastric diseases. PGⅠand PGⅡcan be detected simultaneously. A one step and double antibody sandwich method was utilized. Antigen-antibody reactions were carried out on the surface of magnetic microparticles and the lanthanide elements of Eu3+and Sm3+were labelled to antibodies to PGⅠand PGⅡas fluorescent tracers. Then，the magnetic microparticles-based TRFIA for the simultaneous determination of PGⅠand PGⅡwas developed. The performance of assay was evaluated in some parameters. The results of evaluating performance properties were presented as follows. Sensitivity of PGⅠand PGⅡwere up to 0.15 ng/mL and 0.16 ng/mL，respectively. Detection range of PGⅠand PGⅡwere 0.15-500.00 ng/mL和0.16-50.00 ng/mL，respectively. Accuracy test had a good result ranged from 94.2% to 107.6%. The experimental data demonstrated that accuracy，precision and specificity of the method can meet the requirements of clinical testing. Finally，61 clinical serum samples were simultaneously tested with home-made reagents and chemiluminescence reagents obtained from Abbott Laboratories. Results showed a high degree of concordance and no significant difference among them. It demonstrated that the combination of magnetic microparticles and TRFIA had a great performance in the case of PGⅠand PGⅡand would play an important role in the diagnosis and monitoring of patients with various gastric diseases and high-throughput blood screening.

magnetic microparticles; time-resolved fluoroimmunoassay; pepsinogen; gastric cancer

2015-12-22

国家自然科学基金(21575058)资助

林颜玉(1979-)，女，副主任技师，E-mail:22277446@qq.com;吴英松，通信作者，教授，博导，E-mail:wg@smu.edu.cn

1000-2375(2016)06-0561-06

TR446.6； R735.2

A

10.3969/j.issn.1000-2375.2016.06.016