番茄抗黄化曲叶病毒病杂交后代比较

张 杰， 王先裕， 荆子桓， 孙岚明

(广西大学农学院，广西南宁530000)



番茄抗黄化曲叶病毒病杂交后代比较

张 杰， 王先裕*， 荆子桓， 孙岚明

(广西大学农学院，广西南宁530000)

[目的]筛选黄化曲叶病毒病抗性高的番茄杂交子1代。[方法]通过番茄杂种子1代的栽培，观测各组合的田间生长情况，对各组合果实营养品质指标进行测定和分析，采用分子标记等方法对其黄化曲叶病毒病抗性进行鉴定。[结果]杂交子1代TW002和TW008果实品质较优，在加工、运输、贮藏方面具有优势；与TW002相比，TW008的果实商品率更高、营养品质更好。黄化曲叶病毒病抗性基因检测结果表明，Ty-1中TW001、TW004、TW008和TW010为抗病材料，而TW003、TW005、TW006、TW009为杂合材料，TW002、TW007为感病材料；Ty-2中均为感病材料；Ty-3中TW001、TW002、TW004、TW007、TW009为抗病杂合材料，TW003、TW005、TW006、TW008和TW010为感病纯合材料。[结论]该研究可为抗黄化曲叶病毒病番茄材料的选育提供理论依据。

番茄黄化曲叶病毒；分子标记；杂交子1代；选择；营养品质

番茄(LycopersiconesculentumMiller.)为双子叶植物纲茄科 (Solanaeeae)番茄属(Lycopersion)植物。番茄营养丰富，富含人们正常生活所需的各种物质，如蛋白质、碳水化合物、维生素C、胡萝卜素和番茄红素等[1]。番茄黄化曲叶病是由番茄黄化曲叶病毒( Tomato yellow leaf curl cirus，TYLCV) 引起的，该病毒主要通过烟粉虱(Bemisiatobaci)传染给番茄[2]。该病传播迅速、范围广、危害程度严重、持续久，严重影响番茄的品质和产量。目前番茄黄化曲叶病毒病的防治措施主要是使用抗性品种和农药。长期使用农药易出现农药残留、土壤板结、环境污染、毒素积累等问题，不利于生态农业的发展以及环境的保护，因此现在多采用综合生物防治的方法来防治番茄黄化曲叶病毒病[3]。1994 年，国外学者研究发现智利番茄是最好的番茄抗黄化曲叶病毒病资源[4]。Vidavsky等[5]从番茄中发现抗黄化曲叶病毒基因。Zamir等[6]利用RFLP标记，首次将番茄抗黄化曲叶病的基因定位在6号染色体上(位于着丝粒端)，并将其命名为Ty-1，且RFLP标记方法也被应用于Ty-1的抗病辅助育种中。Hanson等[7]以野生多毛番茄为材料，利用RFLP标记将番茄抗黄化曲叶病的基因定位在了11号染色体的长臂终端上，并将其命名为Ty-2，该方法也被应用于Ty-2的抗病辅助育种中。Ji等[8]以智利番茄为材料，利用RAPD标记确定了抗性位点在第6号染色体上，并将抗性基因命名为Ty-3和Ty-3a。目前，我国番茄黄化曲叶病毒病的危害日趋严重，且番茄抗黄化曲叶病毒病的材料品种较少。基于此，笔者以番茄杂交子1代为研究对象展开试验，观测不同组合材料的田间生长情况、农艺性状表现，利用分子标记等方法对其黄化曲叶病毒病抗性进行鉴定，以期筛选出黄化曲叶病毒病抗性高的番茄杂交子1代，为抗黄化曲叶病毒病番茄材料的选育提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料 试验所用的杂交子1代按TW001～TW010进行编号。这10份材料均由广西大学农学院园艺系番茄课题组提供；对照组(CK)为当前市场上种植面积较为广泛的“艾比利”品种。

1.2 果实营养品质测定项目和方法 每个小区随机抽取3个第2穗外观较好的番茄果实，重复3次，取平均值。果实可溶性固形物含量采用手持折光仪测定[9]；可滴定酸含量采用酸碱滴定法(GB10474-89)测定[10]；抗坏血酸含量采用2,6-二氯酚靛酚滴定法测定[11]；可溶性糖含量采用蒽酮比色法测定[12]；番茄红素含量采用萃取比色法测定；计算糖酸比(可溶性糖与可滴定酸的比值)；利用隶属函数[13]判定果实综合品质，其基本原理是根据评价的标准来构造多个隶属函数，然而每一个评价指标在各个隶属函数的对应程度不同，通过模糊计算，可以得到综合指标对各个隶属函数的数值得分影响。

1.3 番茄抗性基因的检测

1.3.1 试剂和仪器。试剂：2×CTAB(pH 8.0)、NaCl、 EDAB、Tris-d(pH 8.0)、氯仿、异丙醇、醋酸钠、琼脂粉、液氮、无水乙醇、TE缓冲液、dNTP、TEA溶液、TaqDNA聚合酶、MgCl2、BUFFER、6×Loading Buffer、染色碱、2 000 DNA Marker、MIX酶、nuclear free water。仪器：研钵、水浴锅、振荡机、移液枪、点样板、冰箱、磨样机、Sigma1冷冻离心机、ABI 2720 PCR仪、Q5000型核酸蛋白仪、君意JY600C型电泳仪、微波炉、ChemiDoc MP型凝胶成像系统。

1.3.2 DNA的提取。采用改良的CTAB法对番茄材料基因组的DNA进行提取。

1.3.3 PCR反应体系。①黄化曲叶病毒病抗性基因Ty-1参照华中农业大学番茄课题组开发的双重SNP标记[14]；反应体系20 μL：2.0 μL的10× Buffer with Mg2+，0.4 μL的dNTPs(2.5 mM)，正向引物和反向引物(100 μmol/L)各0.2 μL，1.0 μL的DNA 模板(200 ng/μL)，0.2 U的TaqDNA聚合酶，ddH2O 补足20 μL。PCR反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性，1 min，58 ℃复性，1 min，72 ℃延伸，1 min，35个循环；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保持。②黄化曲叶病毒病抗性基因Ty-2、Ty-3参照中国农业科学院蔬菜花卉研究所提供引物程序进行检测。反应体系10 μL： 5 μL的2×GoTaqGreen Master Mix，正向引物和反向引物各0.25 μL，3.50 μL的灭菌ddH2O，1.00 μL的DNA模板(1 000 ng/μL)。PCR反应程序：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性，40 s，55 ℃复性，40 s，72 ℃延伸，1 min 30 s，32个循环；最后72 ℃延伸8 min，16 ℃保存。

1.3.4 PCR及酶切产物检测。PCR产物及酶切产物在1.5%的琼脂糖凝胶上 220 V 恒压电泳15 min，结果采用2 000 DNA Marker染色，ChemiDoc MP型凝胶成像系统拍照。

1.4 数据处理 采用Excel 2007以及SPSS 20.0软件对数据进行处理。

2 结果与分析

2.1 番茄果实品质比较 由表1可知，TW001～TW010番茄果实中的可溶性固形物含量在6.05%～7.64%，其中TW008果实中可溶性固形物含量最高，为7.64%，TW003果实中可溶性固形物含量最低，为6.05%，TW001与TW007之间差异不显著，其余杂交子1代之间差异显著；番茄果实中的可滴定酸含量在327.89～657.55 mg/100 g，其中TW004果实中可滴定酸含量最高，为657.55 mg/100 g， TW001果实中可滴定酸含量最低，为327.89 mg/100 g，TW001与TW004、TW007之间均差异显著，其他材料间均差异不显著；番茄果实中番茄红素含量在24.72～46.79 mg/100 g，其中TW008果实中番茄红素含量最高(为46.79 mg/100 g)，TW003果实中番茄红素含量最低(为24.72 mg/100 g)，TW001、TW003、TW005、TW007、TW008、TW010、CK之间均差异显著，TW002与TW006之间差异不显著；番茄果实中抗坏血酸含量在13.35～31.72 mg/100 g，其中TW008果实中抗坏血酸含量最高，TW003果实中抗坏血酸含量最低，10个杂交子1代材料中除TW010外，其余材料之间均差异显著；番茄果实中可溶性糖含量在297.66～526.80 mg/100 g，其中TW002果实中可溶性糖含量最高，TW006果实中可溶性糖含量最低，这10个杂交子1代材料之间均差异显著；番茄果实中糖酸比在0.49～1.22，其中TW001果实中糖酸比最高， TW007果实中糖酸比最低，这10个杂交子1代材料之间均差异显著。根据隶属函数值可知，TW008得分最高，说明其番茄果实品质最好，TW001、TW002、TW004、TW005、TW007、TW008、TW009和TW010的数值均高于CK，因此，这8个材料均可在广西地区进行推广种植。

表1 大果番茄营养品质对比

注：同列不同小写字母表示处理间在0.05水平差异显著。

Note： Different lowercases in the same column indicated significant differences at 0.05 level between treatments.

2.3.2 抗性鉴定分析

2.2.1 黄化曲叶病毒病抗性基因Ty-1检测结果。Ty-1基因的双重SNP标记可检测出抗病纯合、抗病杂合、感病纯合材料，当纯合抗病材料经过PCR电泳过后，会出现1条965 bp的条带，杂合抗性材料会出现965 bp和1 343 bp 2条DNA带，而纯合感病材料会出现1条1 434 bp的条带。由图1可知，TW001、TW004、TW008和TW010为抗病材料，而TW003、TW005、TW006、TW009为杂合材料，TW002、TW007为感病材料。

图1 黄化曲叶病毒病抗性基因Ty-1检测结果Fig. 1 Detection results of resistance gene Ty-1 of yellow leaf curl virus

2.2.2 黄化曲叶病毒病抗性基因Ty-2检测结果。含有黄化曲叶病毒病抗性基因Ty-2的材料可扩增出300 bp的条带，不含黄化曲叶病毒病抗性基因Ty-2的感病材料则扩增出600 bp的条带。由图2可知，所有的材料均为感病材料。

图2 黄化曲叶病毒病抗性基因Ty-2检测结果Fig. 2 Detection results of resistance gene Ty-2 of yellow leaf curl virus

2.2.3 黄化曲叶病毒病抗性基因Ty-3检测结果。含有黄化曲叶病毒病抗性基因Ty-3的材料可扩增出500 bp的条带，不含黄化曲叶病毒病抗性基因Ty-3的材料可扩增出320 bp的条带。由图3可知，TW001、TW002、TW004、TW007、TW009为抗病杂合材料，TW003、TW005、TW006、TW008和TW010为感病纯合材料。

图3 黄化曲叶病毒病抗性基因Ty-3检测Fig. 3 Detection results of resistance gene Ty-3 of yellow leaf curl virus

3 结论与讨论

(1)该试验结果表明，杂交子1代TW002和TW008的可滴定酸、可溶性糖、抗坏血酸含量均较高，其口味、风味、甜酸比、酸碱度等较优，更有益于贮藏，在加工、运输方面均有优势，与TW002相比，TW008的果实商品率更高、营养品质更好。与对照品种“艾比利”相比，10个杂交子1代中有8个得分高于“艾比利”，尤其是TW008，适合大面积推广。

(2)黄化曲叶病毒病抗性基因检测结果表明，Ty-1中TW001、TW004、TW008和TW010为抗病材料，而TW003、TW005、TW006、TW009为杂合材料，TW002、TW007为感病材料；Ty-2中均为感病材料；Ty-3中TW001、TW002、TW004、TW007、TW009为抗病杂合材料，TW003、TW005、TW006、TW008和TW010为感病纯合材料。TW001、TW004为纯合体且抗Ty-1和Ty-3，可作为亲本材料；TW003、TW005、TW006、TW009均为杂合材料，需继续纯化；TW002、TW007材料经济性状一般，但感Ty-1、抗Ty-3。TW008感病但经济性状好，可作母本，TW010感病又无性状，应该淘汰。

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科技论文写作规范——讨论

着重于研究中新的发现和重要方面，以及从中得出的结论。不必重复在结果中已评述过的资料，也不要用模棱两可的语言，或随意扩大范围，讨论与文中无多大关联的内容。

Comparison on Resistance to Tomato Yellow Leaf Curl Disease of Hybrid Offspring

ZHANG Jie, WANG Xian-yu*, JING Zi-huan et al

(College of Agronomy, Guangxi University, Nanning, Guangxi 530000)

[Objective] To screen the tomato hybrid F1with high resistance to tomato yellow leaf curl disease. [Method] Through the cultivation of tomato hybrid F1, field growth situation of each combination was observed. The fruit nutritional quality index of each combination was detected and analyzed. Molecular marker and other methods were used to identify the resistance to yellow leaf curl disease. [Result] Fruit qualities of F1TW002 and TW008 were relatively better. Genetic testing results of yellow leaf curl disease showed that TW001, TW004, TW008 and TW010 inTy-1 were all resistant materials; TW001, TW002, TW004, TW007 and TW009 inTy-3 were disease-resistant hybrid materials; TW003, TW005, TW006, TW008 and TW010 were infected homozygous materials. [Conclusion] This research provides theoretical foundation for the resistance breeding of tomato yellow leaf curl disease.

Tomato yellow leaf curl virus; Molecular marker; Hybrid F1; Selection; Nutritional quality

广西科学研究与技术开发计划项目(桂科攻14121006-5-2，桂科合14123001-3，桂科攻13254002-2)；国家大宗蔬菜产业技术体系桂林综合试验站项目(CARS-25-G-37)；百色国家农业科技园区建设示范项目(桂科能1598022-1-1)；番茄新品种选育及示范(BB160112)。

张杰(1994-)，男，广西玉林人，本科生，专业：园艺。*通讯作者，研究员，从事番茄抗病育种与新品种选育。

2016-08-17

S 641.2

A

0517-6611(2016)29-0014-03