莪术醇与奥沙利铂联合肿瘤内注射对裸鼠胃癌移植瘤生长、瘤细胞增殖的影响及其机制

王冬，李勇，郭志朋，赵群，范立侨，檀碧波，崔平

(1河北医科大学第四医院，石家庄050011；2河北省人民医院)



莪术醇与奥沙利铂联合肿瘤内注射对裸鼠胃癌移植瘤生长、瘤细胞增殖的影响及其机制

王冬1，李勇1，郭志朋1，赵群1，范立侨1，檀碧波1，崔平2

(1河北医科大学第四医院，石家庄050011；2河北省人民医院)

目的 观察莪术醇与奥沙利铂联合肿瘤内注射对裸鼠胃癌移植瘤生长、瘤细胞增殖的影响，并探讨其机制。方法 20只裸鼠，建立胃癌移植瘤模型，将其随机分为对照组、莪术醇组、奥沙利铂组、联合组各5只，对照组肿瘤内注射生理盐水(0.05 mL/10 g)，莪术醇组肿瘤内注射莪术醇(100 mg/kg)，奥沙利铂组肿瘤内注射奥沙利铂(30 mg/kg)，联合组肿瘤内注射莪术醇(100 mg/kg)与奥沙利铂(30 mg/kg)，每4 d 1次，共4次。观察各组肿瘤生长情况，MTT法测算各组肿瘤组织中的瘤细胞存活率，荧光定量PCR检测各组肿瘤组织Bcl-2、Caspase-3 mRNA，免疫组化法检测各组肿瘤组织Bcl-2、Caspase-3蛋白。结果 与对照组相比，联合组、莪术醇组、奥沙利铂组肿瘤体积小、重量低、瘤细胞存活率低、Caspase-3表达高、Bcl-2表达低，且联合组变化更明显(P均<0.05)。结论 莪术醇联合奥沙利铂肿瘤内注射可抑制裸鼠胃癌移植瘤生长并抑制瘤细胞增殖，这可能与上调Caspase-3、下调Bcl-2表达有关。

莪术醇；奥沙利铂；胃癌；裸鼠移植瘤模型；B淋巴细胞瘤2；含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶

研究[1]发现，中药及其提纯物联合化疗药物治疗胃癌术后，在提高患者生存质量、延长生存期、提高免疫功能、减轻化疗毒副作用等方面均优于单纯化疗。莪术醇是中药莪术的主要有效成分，对于结肠癌、肺癌、胃癌、骨肉瘤等多种肿瘤细胞具有明显的抑制作用[2～5]。莪术醇可以抑制肿瘤细胞增殖、促进凋亡，还可以通过调控一些信号通路的表达及活性而对肿瘤细胞发挥抑制作用。但这些结果大多是由体外研究得来，有关莪术醇抗肿瘤的体内研究少见。本研究观察了莪术醇与奥沙利铂联合肿瘤内注射对裸鼠胃癌移植瘤生长、瘤细胞增殖的影响，并探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及试剂 22只4～5周龄、雄性BALB/c裸鼠，体质量17.5～23.5 g，购于北京华阜康生物科技股份有限公司，SPF级饲养。莪术醇纯品购自中国食品药品检定研究院(纯度>99%)；Bcl-2、Caspase-3基因引物由上海生工生物公司合成，抗体为美国Santa Cruz公司产品。

1.2 细胞培养 胃癌细胞株BGC-823(河北医科大学第四医院科研中心)细胞在37 ℃、5% CO2、相对湿度为95%培养箱中常规培养，培养液为含有10%胎牛血清的RPMI1640。细胞2～3 d换液1次，常规传代。

1.3 裸鼠胃癌移植瘤模型制备 将对数生长期的BGC-823细胞(3.0×106/mL)0.2 mL注射于2只裸鼠腋部皮下。在瘤体直径约1.0 cm时，处死裸鼠，剥离瘤体，剪成约1 mm3的瘤块种植于20只裸鼠的腋部皮下，当瘤体直径约1.0 cm时开始后续实验。

1.4 莪术醇、奥沙利铂用法 将20只荷瘤裸鼠模型随机分为对照组、莪术醇组、奥沙利铂组、联合组各5只，对照组肿瘤内注射生理盐水(0.05 mL/10 g)，莪术醇组肿瘤内注射莪术醇(100 mg/kg)，奥沙利铂组肿瘤内注射奥沙利铂(30 mg/kg)，联合组肿瘤内注射莪术醇(100 mg/kg)与奥沙利铂(30 mg/kg)，每4 d 1次，共4次。计算肿瘤体积，肿瘤体积=1/2×a×b2(a、b分别代表移植瘤最长径和最短径，单位mm)。第17天处死裸鼠，剥离瘤体、称量瘤重(g)，计算抑制率。抑制率=(对照组瘤重-实验组瘤重)/对照组瘤重×100%。

1.5 瘤细胞增殖检测 采用MTT法。将刚离体的瘤体制成单细胞悬液。取对数生长期的瘤细胞悬液(3.1×104/mL)，接种于96孔板，每组设5个复孔，每孔200 μL含10%小牛血清的培养液。在CO2培养箱中分别培养24、48、72 h后，加入20 μL浓度为5 mg/mL的MTT，继续培养4 h，弃上清，加入150 μL的DMSO，震荡10 min。测定波长为490 nm的光密度(OD)值。细胞存活率(%)=实验组OD值/对照组OD值×100%。

1.6 肿瘤组织Bcl-2、Caspase-3 mRNA检测 采用荧光定量PCR法。取-80 ℃保存的肿瘤组织约200 mg，TRIzol提取RNA，检测RNA完整性和纯度，逆转录合成cDNA。以合成的cDNA为模板，进行目的基因的扩增。PCR反应体系为cDNA 2.0 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，DEPC水7 μL，SYBR Green Supermix 10 μL。PCR反应参数为95 ℃预变性10 min、95 ℃变性15 s、60 ℃退火60 s，40个循环，72 ℃延伸30 s。扩增完毕后，进入结果分析界面，以GAPDH为内参照基因，按照2-ΔΔCt相对定量公式，计算出各组目的基因相对表达量。

1.7 肿瘤组织Bcl-2、Caspase-3蛋白检测 将甲醛固定的瘤组织制成蜡块，切片，进行HE染色和免疫组织化学染色(S-P法)。以PBS代替一抗作为阴性对照。光镜下(400×)随机观察5个视野，采取二次计分法，首先按染色强度计分，无色计0分，淡黄色计1分，棕黄色计2分，棕褐色计3分；再按阳性细胞百分比计分，阴性计0分，阳性细胞≤10%计1分，>10%～50%计2分，>50%～75%计3分，>75%计4分。将染色强度得分和细胞数得分的乘积判断表达结果，0<积分≤2为弱表达，>2为强表达。

2 结果

2.1 各组裸鼠肿瘤体积、重量比较 联合组、莪术醇组、奥沙利铂组、对照组第17天肿瘤体积分别为(1 087.00±120.95)、(1 674.77±170.85)、(1 322.20±135.10)、(2 081.64±193.69)mm3，肿瘤重量分别为(0.96±0.11)、(1.48±0.10)、(1.36±0.17)、(2.02±0.23)g，联合组、莪术醇组、奥沙利铂组与对照组相比，联合组与莪术醇组、奥沙利铂组相比，P均<0.05。联合组、莪术醇组、奥沙利铂组、对照组肿瘤抑制率分别为51.8%±6.3%、26.0%±12.3%、31.9%±11.3%、100.0%。

2.2 各组裸鼠肿瘤组织瘤细胞存活率比较 结果见表1。

2.3 各组裸鼠肿瘤组织Bcl-2、Caspase-3 mRNA比较 见表2。

2.4 各组裸鼠肿瘤组织Bcl-2、Caspase-3蛋白比较 联合组、莪术醇组、奥沙利铂组、对照组Caspase-3强表达阳性率分别为93.33%、66.67%、86.67%、26.67%，Bcl-2强表达阳性率分别为13.33%、23.33%、25.00%、86.67%，联合组、莪术醇组、奥沙利铂组与对照组相比，联合组与莪术醇组、奥沙利铂组相比，P均<0.05。

表1 不同培养时间各组裸鼠肿瘤组织瘤细胞存活率比较

注：与对照组相比,*P<0.05；与莪术醇组、奥沙利铂组相比,#P<0.05。

表2 各组裸鼠肿瘤组织Bcl-2、Caspass-3 mRNA相对表达量比较±s)

注：与对照组相比,*P<0.05；与莪术醇组、奥沙利铂组相比,#P<0.05。

3 讨论

胃癌的治疗是综合治疗[6]。化疗在胃癌的治疗中占有重要的地位，但可导致胃癌细胞药物抵抗的形成，最终导致化疗失败。奥沙利铂是用于胃癌化疗的一线药物，同样存在上述问题，故联合新药物治疗改善奥沙利铂的治疗效果有重要意义。近年来，中药及其提取物已成为研究的重点。中药抗肿瘤具有多靶点、多环节、多效应的特点，并且毒副作用较小，能提高患者免疫力，不易产生耐药性[7]。莪术醇为近年受关注的药物之一。

莪术是姜科姜黄属的草本植物，在中医治疗中应用较为广泛。该药具有行气破瘀、止痛等疗效，多用于胃胀气滞、腹痛等症候的治疗。中医认为患者情志不舒、饮食不调、痰凝气滞、热毒血瘀交阻于胃而导致胃癌发生。莪术用于胃癌治疗有其中医理论依据。莪术醇是莪术的提取物，也是其主要有效成分，具有抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡的作用。对胃癌细胞的体外研究也证实了这一点[4,8]。本研究应用人胃癌细胞株皮下移植技术成功制备了裸鼠胃癌移植瘤模型，比较了不同处理方式对肿瘤的影响。结果发现，与对照组相比，莪术醇、奥沙利铂分别及联合应用鼠肿瘤体积减小、质量降低，且联合用药作用最为明显。这一结果说明莪术醇对胃癌有治疗作用，莪术醇与奥沙利铂联合应用效果更佳。为从细胞学角度观察莪术醇、奥沙利铂的作用，本研究应用MTT法检测了各组瘤细胞的活性。结果显示，莪术醇单独应用即有抑制肿瘤生长的作用，并可降低瘤细胞活性，与奥沙利铂联合应用后抑制肿瘤细胞活性的作用更为明显。提示莪术醇在胃癌治疗中可能有较好的应用前景。为了解莪术醇抑制胃癌的生长的分子机制，本研究进一步检测了各组肿瘤组织中的Bcl-2和Caspase-3。Bcl-2和Caspase-3是反映胃癌细胞凋亡的重要指标[9,10]。胃癌细胞具有较强的凋亡抵抗能力，这是胃癌铂类药物治疗不理想的重要原因。本研究结果发现，与对照组相比，联合组、奥沙利铂组、莪术醇组Caspase-3表达升高且Bcl-2表达下降。说明莪术醇对胃癌的治疗效果可能与其上调Caspase-3、下调Bcl-2表达有关。但莪术醇与奥沙利铂联合应用的实际效果及最适用药方案还有待大规模的临床研究。

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Effects of curcumol combined with oxaliplatin on xenograft growth and proliferation of gastric cancer tumor cells in nude mice

WANGDong1,LIYong,GUOZhipeng,ZHAOQun,FANLiqiao,TANBibo,CUIPing

(1TheFourthAffiliatedHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050011,China)

Objective To observe the effects of curcumol combined with oxaliplatin on xenograft growth of gastric cancer cells in nude mice, then to explore the mechanism.Methods Twenty nude mice were selected to establish the xenograft models of gastric cancer cells in nude mice. Nude-mice xenograft models were randomly divided into four groups (n=5 in each group): the control group, curcumol group, oxaliplatin group and curcumol combined with oxaliplatin group (combined treatment group), then they were respectively treated with normal saline (0.05 mL/10 g), curcumol (100 mg/kg), oxaliplatin (30 mg/kg) and curcumol (100 mg/kg) combined with oxaliplatin (30 mg/kg), once every 4 days for four times. The growth of tumor was recorded. The cell survival rate of tumor cells in cancer tissues was determined by MTT. The expression levels of Caspase-3, Bcl-2 mRNA and protein were detected by fluorescence quantitative RT-PCR and immunohistochemistry. Results Compared with the control group, the tumor volume, weight, cell survival rate and the expression of Bcl-2 was decreased but the expression of Caspase-3 was increased in the curcumol group, oxaliplatin group and combined treatment group, and these changes were more significant in the combined treatment group (allP<0.05).Conclusion The curcumol combined with oxaliplatin may inhibit the xenograft growth and proliferation of gastric cancer tumor cells in nude mice, and the mechanism may be related to the up-regulation of Caspase-3 and down-regulation of Bcl-2.

curcumol; oxaliplatin; gastric carcinoma; xenograft models in nude mice; Bcl-2, Caspase-3

国家自然基金面上项目(81372580)；河北省中医药管理局科研基金资助项目(2014145D)。

王冬(1974-)，男，博士，副教授，主要从事胃癌新药物疗法的研究。E-mail: wangdongcuiping@126.com

简介：李勇(1958-)，男，博士，教授，博士生导师，主要从事消化道恶性肿瘤基础与临床的研究。E-mail: li_yong_hbth@126.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.35.006

R735.2

A

1002-266X(2016)35-0021-03

2015-12-27)