AtmiR156a调控菊苣营养生长与品质

李小冬，蔡璐，张瑜，王茜，莫本田，韩永芬，王小利

(贵州省草业研究所，贵州 贵阳 550006)



AtmiR156a调控菊苣营养生长与品质

李小冬，蔡璐，张瑜，王茜，莫本田，韩永芬，王小利*

(贵州省草业研究所，贵州 贵阳 550006)

菊苣是南方草地生态畜牧业发展的重要牧草资源，其产量与植物营养生长阶段长短密切相关。本研究采用转基因的方法将拟南芥AtmiR156a在菊苣中过量表达，获得了140株转基因植株，PCR检测阳性率达94.3%。荧光定量PCR分析发现转基因菊苣中AtmiR156a表达量上调7.9倍。AtmiR156a过量表达菊苣与野生型菊苣的发芽率基本相当，但其叶片发生速率显著比野生型快，抽薹时间比野生型推迟20.2 d，开花推迟27.3 d，但是株高比野生型要矮，年均产草量与野生型基本相当。分析第一茬草的品质性状发现AtmiR156a过量表达菊苣叶片中粗蛋白含量比野生型高3.7%，纤维素降低2%，其他品质性状在两个材料中没有显著差异。本研究不仅建立了高效的菊苣遗传转化体系，培育出晚花、速生的菊苣新种质资源，为培育高产耐刈菊苣新品种奠定基础，同时为开展借助其他农作物重要功能基因进行菊苣遗传改良的研究工作提供借鉴，具有重要的理论研究与实际应用价值。

菊苣；AtmiR156a；营养生长；牧草品质

菊苣(Cichoriumintybus)是菊科多年生宿根植物，因含有丰富的营养物质同时具有良好的医药价值，被广泛用做食物、饲料以及中药材原料。作为青鲜牧草，其综合营养价值高，粗蛋白、粗脂肪、粗纤维、无氮浸出物和粗灰分含量等指标都优于“牧草之王”紫花苜蓿(Medicagosativa)[1]。此外，牧草菊苣适口性好，消化率高，利用年限长，并且适应性广，产草量高，可用于建设高产人工割草场和放牧场[2]。然而栽培管理中，刈割时间对其影响很大，过早牧草产量太低，过晚影响牧草品质，同时还容易发生根腐病。因此，开发和利用高产耐刈菊苣新种质，对弥补贵州人工草地高产优质牧草不足具有建设性意义。植物营养生长期的长短决定着牧草生物产量和品质，而开花是植物由营养生长转向生殖生长最明显的形态标记之一，因此人们对于植物开花的分子机制进行了深入的研究，并发现开花是由光周期、春化、赤霉素和自主途径4条主要的信号途径来调控。最近的研究发现小RNAmiR156对植物营养生长与作物品质都起着十分重要的调控作用。

miR156是植物界中一个结构和功能高度保守的小RNA，过量表达miR156的拟南芥(Arabidopsisthaliana)营养生长期显著延长，生物产量显著增加；而通过靶基因模拟方法转化mimicry156植株营养期明显缩短，开花提前[3]。玉米(Zeamays)显性突变体Corngrass(Cg)的叶片细长、分蘖增加且营养生长旺盛，最近研究发现Cg是由于miR156b和miR156c上调表达造成[4]。类似的表现型在miR156过量表达的水稻(Oryzasativa)植株中也能够观察到，miR156上调表达的水稻植株分蘖增加，植株矮化，开花推迟，生物产量大大增加[5]。这些突变体的幼年期延长，能够产生更多的幼嫩叶片，部分花器官发育成叶片。综上所述，在不同植物中，miR156的上调表达能够不同程度地延长营养生长的时间，促进植物生物产量的提高，并且其生物学功能在单子叶与双子叶植物中高度保守。

miR156不仅可以影响植物的生物产量，对作物的抗逆性和生物学品质都有影响。在小麦(Triticumaestivum)及大白菜(Brassicarapa)中，高温胁迫导致miR156表达上调[6-7]。除受温度影响外，磷胁迫也调节miR156的表达。在缺磷时，拟南芥中miR156上调表达[8]。在作物品质改良方面，在油菜(Brassicanapus)中过量表达miR156能使油菜种子积累大量胡萝卜素及叶黄素，而转基因油菜的种子产量及质量则不受影响[9]。在能源模式植物柳枝稷(Panicumvirgatum)中过量表达miR156，转基因材料的生物产量、可溶性糖含量、淀粉含量以及可消化程度都显著提高[10-11]，为生物燃料的生产提供了重要的种质材料。同样，在玉米突变体Corngrass中，由于miR156过量表达，突变体叶子中的纤维素、半纤维素含量显著低于对照[12]。因此在牧草中通过过量表达miR156具有同时改良作物的产量与品质的潜力。

菊苣的遗传转化体系自20世纪90年代开始就已经开展研究，并已经建立了多种植株再生体系与遗传转化技术[13-14]，成功培育出一些耐盐[15-16]、抗旱[17]及抗冻害等种质资源。然而通过转基因技术对菊苣产量和耐刈割等性状改良还没有报道。通过对本项目的研究不仅能够满足贵州高效畜牧业园区对高产优质牧草的需求，同时晚花耐刈型新种质资源也是中药材的候选材料，具有较大经济实用价值。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究采用的植物材料为黔引普那菊苣(2006年贵州省草业研究所育成)，植株生长条件参考Li等[18]的方法，具体为光照16 h，黑暗8 h，生长温度22 ℃，光照强度为230～300 μE/(m2·s)。RNA提取试剂盒购自Axygen公司，RNA反转录试剂盒购自Invitrogen公司，荧光定量PCR试剂盒购自Takara公司。

1.2 方法

1.2.1AtmiR156a的克隆及过量表达载体的构建 利用Phusion高保真DNA聚合酶(Thermo)从拟南芥基因组DNA中克隆出AtmiR156a全长DNA片段，引物组合为lxdp 020:(ctaggatccATTCTCATCGTTTCTTGTTTTC, BamHⅠ接头)与lxdp 021:(ctagagctcAAGCCAGAGTTTAGATCGTATC,SacⅠ接头)，PCR反应混合物：5×Phusion buffer，4 μL；10 mmol/L dNTP，0.5 μL；25 mmol/L MgCl2，1.5 μL；10 mmol/L lxdp020，1 μL；10 mmol/L lxdp021，1 μL；DNA，2 μL；Phusion DNA聚合酶，0.2 μL；dd H2O，10 μL。反应程序：98 ℃ 1 min，98 ℃ 10 s，58 ℃ 10 s，72 ℃ 30 s，30个循环，72 ℃ 5 min。通过测序分析后，用BamHⅠ与SacⅠ酶切连接到pBI121过量表达载体，并将其转化到GV3101农杆菌菌株中备用。

1.2.2 菊苣遗传转化 采用组培方法实现对菊苣转化，将暗光培养子叶在活化的农杆菌中浸染10 min，每5 min轻轻摇晃培养皿一次，将侵染后的外植体转到M1培养基中[1/2 MS+10 g/L蔗糖+0.01 mg/L 噻苯隆(TDZ)+1 mg/L 生长素(IAA)]，置于人工气候室中共培养2 d。用含有100 mg/mL头孢霉素的无菌水清洗共培养的外植体2～3次，然后将外植体转移到M2[MS+10 g/L蔗糖+2 mg/L 苄氨基喋呤(6-BA)+1 mg/L 生长素(IAA)+50 mg/L 卡那霉素(Km)]培养基上培养至长出绿色愈伤。将绿色愈伤转到M3[MS+10 g/L蔗糖+1 mg/L 苄氨基喋呤(6-BA)+1 mg/L 生长素(IAA)+50 mg/L卡那霉素(Km)]培养基中，每星期继代一次，直至绿芽长至2～5 cm。将再生植株从愈伤组织上切下，插入到M4[MS+10 g/L蔗糖+1 mg/L 萘乙酸(NAA)+50 mg/L卡那霉素(Km)]培养基中生根培养15～20 d，直到根系发育完成。将无菌苗移栽到泥炭土∶蛭石=1∶1的基质中，置于人工气候室培养。

1.2.3 转基因菊苣鉴定 采用天根DNA提取试剂盒(DP305-2)提取转化植株的DNA，采用PCR扩增载体上NPT抗性基因的方法检测阳性转基因植株，引物组合：NPTF (5′-GTGCCCTGAATGAACTGC-3′)与NPTR (5′-CAATATCACGGGTAGCCA-3′)，PCR反应混合物：2×Taq PCR Mixture(上海生工)，10 μL； NPTF(10 mmol/L)，1 μL； NPTR(10 mmol/L)，2 μL；dd H2O，6 μL；DNA，1 μL。反应程序为：94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s，30个循环，72 ℃ 5 min。

1.2.4 转基因菊苣荧光定量分析AtmiR156a的表达分析参考[19]。利用Trizol提取转基因以及对照菊苣的RNA进行逆转录，逆转录引物序列为：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATA CGACGTGCTC，采用PCR方法检测AtmiR156a的表达变化，引物组合：上游引物(5′-GCGGCGGTGACAGAAGAGAGT-3′)与下游引物(5′-GUGCUCACUCUCUUCUGUCA-3′)，荧光定量反应混合物：10×Buffer，2 μL；10 mmol/L dNTP，0.4 μL；50 mmol/L MgCl2，1 μL；上游引物 (10 mmol/L)，0.5 μL； 下游引物(10 mmol/L)，0.5 μL；20×核酸染料(Eva green)，1.0 μL；高保真DNA聚合酶(Platinum Taq)，0.1 μL；H2O，11.5 μL；模板，3 μL。反应程序为：95 ℃ 1 min，95 ℃ 20 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，读取荧光信号，45个循环，72 ℃ 5 min。

1.2.5 转基因菊苣性状调查 叶片发生速率：在人工气候室中，盆栽野生型和转基因菊苣(T2代，转基因株系编号为菊苣At156-15)各30株，发芽后每7 d统计叶片数，以肉眼可见的叶片统计为1片叶。发芽率调查：取2015年同年收获的野生型以及转基因菊苣(T2代，转基因株系编号菊苣At156-15)饱满种子，在10 cm的培养皿中加4层灭菌滤纸，用无菌水浸透，倒出多余水分，每个培养皿播种30颗种子，每个材料重复4次，每3 d统计发芽率。抽薹期、花期、株高与产量统计的为T1代植株，平行种植野生型和转基因菊苣各20个单株(T1代)，野生型为2013年组织培养获得，转基因材料为同年转化检测后阳性植株。将检测后的转基因以及组培的材料野生型菊苣移栽大田，间距为50 cm×50 cm，种植于2013年10月，调查统计于2014年，调查抽薹期、花期转基因编号为菊苣At156-1～20，以肉眼可见的茎节定义为抽薹，以第一朵花开放定义为开花。调查株高与产量转基因株系编号为菊苣At156-21～40，株高：测量刈割前两组材料从地面到植株顶端高度。产量：当植物生长到40～60 cm时(营养生长时期)开始刈割测产，刈割4次，将各茬草产量相加，再折合成每m2的产草量。

1.2.6 品质分析 取营养生长期的第一茬菊苣叶片(T1代植物)分析牧草营养品质，测定牧草粗纤维、粗蛋白、粗脂肪以及灰分等营养物质成分的含量。测定方法按照国标方法进行，其中粗蛋白参照GB/5915-2008，粗脂肪参照GB/T6433-2006，粗纤维参照GB/T 6434-2006，粗灰分参照GB/T 6438-2007进行测定，每个指标测定6个独立植株。

1.3 数据分析

采用Excel 进行实验数据分析，荧光定量、营养品质以及物候期性状差异显著性分析采用t测验，P<0.05被认为是差异显著，作图采用Excel 与PowerPoint。

2 结果与分析

2.1AtmiR156a的克隆与表达载体的构建

图1 AtmiR156a的克隆与载体构建Fig.1 Cloning of AtmiR156a and constructing of pBI121-AtmiR156a vector酶切回收AtmiR156a(A)与pBI121(B)，并连接成pBI121-AtmiR156a过量表达载体(C)。 Gel-recycle of AtmiR156a (A) and pBI121 (B), then ligate into pBI121-AtmiR156a overexpression vector (C).

以野生型拟南芥基因组DNA为模板，采用Phusion DNA聚合酶扩增包含整个成熟AtmiR156a片段(约1000 bp)的基因组序列，并进行测序分析得到正确的序列。分别利用BamHⅠ与SacⅠ酶切pMD19-AtmiR156a与pBI121空载体，并回收对应目的片段(图1A，B)，利用T4连接酶连接线性化载体和目的基因完成载体构建(图1C)。

2.2AtmiR156a转化菊苣获得与鉴定

利用农杆菌介导的组织培养法将AtmiR156a转入黔引普那菊苣。在愈伤诱导阶段加入50 mg/L卡那霉素进行筛选，经过15～20 d的诱导，转化成功的细胞能形成绿色愈伤(图2A)，将分生旺盛的愈伤转移到含有50 mg/L Km分化培养基培养25～30 d(图2B)，将3～5 cm的再生芽转移到生根培养基上培养14 d(图2C)，将转基因苗转移到泥炭土培养基质炼苗(图2D)，并通过PCR扩增抗性基因检测阳性转基因植株，共获得了140个再生植株，132个能够扩出NPT条带，阳性率达94.3%(图2E)，采用35S与AtmiR156下游引物随机检测22个单株都是阳性(图2F)。

图2 AtmiR156a转化菊苣及其抗性检测与表达分析检测Fig.2 The processes and detections of AtmiR156a transgenic chicory A：外植体培养愈伤；B：愈伤分化成苗；C：生根培养；D：炼苗移栽；E：转基因苗抗性分子(NPT引物)检测示意图，其中M为DNA maker，1～20为样品，21为阴性对照(非转基因菊苣)，22为阳性对照(pBI121质粒)；F：转基因苗抗性分子(基因特异引物)检测示意图，其中M为DNA maker，1～22为样品，23为阴性对照(非转基因菊苣)，24为阳性对照(pBI121质粒)；G：转基因菊苣miR156a荧光表达分析，1是野生型菊苣，2是AtmiR156转基因菊苣，用actin基因做内参, 3个生物学重复，*表示差异在P<0.05达显著水平。A: Induction of callus from cotyledon explants. B: Regeneration seedlings inducted from calluses. C: Rooting of the regeneration transgenic seedlings. D: Acclimatization and transplantation. E: Representative pictures of molecular detection of transgenic plants based on PCR analysis with NPT primiers, M stands for DNA maker, 1-20 were plants samples, 21 was the negative control (non-transgenic plants), 22 was the positive control (plasmid). F: Representative pictures of molecular detection of transgenic plants based on PCR analysis with gene specific primiers, M stands for DNA maker, 1-22 were plants samples, 23 was the negative control (non-transgenic plants), 24 was the positive control (plasmid). G: qRT-PCR analysis of transgenic plants, 1 was the wild chicory, 2 was the AtmiR156 transgenic chicory plants, actin was used as internal control, n=3. *stands for a significant difference at P<0.05 level.

2.3 转AtmiR156a菊苣基因表达分析

采用荧光定量PCR的方法分析阳性转基因菊苣与野生型菊苣中AtmiR156a的表达变化。在野生型菊苣中只检测到微量AtmiR156a的表达，而在转基因菊苣中，miR156a表达量显著升高7.9倍(图2G)，说明转化的AtmiR156a能够在菊苣中正常表达行使功能。

2.4 转AtmiR156a菊苣品质性状分析

平行比较转基因菊苣与对照普那菊苣营养组分的变化，以第一茬草的叶片组织为样品，其粗蛋白含量达23.5%，比普那菊苣高3.7%；纤维素含量为12.3%，比普那菊苣低2%；与对照相比，粗脂肪、无氮浸出物、粗灰分、钙以及磷等含量都与野生菊苣没有显著差异(表1)。

表1 AtmiR156a转基因菊苣品质分析

n=6，*表示差异在P<0.05达显著水平。 *stands for a significant difference atP<0.05 level.

2.5 转AtmiR156a菊苣农艺性状调查

通过盆栽试验比较转AtmiR156a菊苣与野生型菊苣发芽速率以及早期叶片发生速率。在人工气候条件下，转基因菊苣的发芽速率与野生菊苣相当，在第3～4天开始发芽，第7～8天发芽速度最快，10～12 d转基因和野生型材料基本全部发芽，但野生型与转基因材料差异不显著(图3A)。在早期叶片发生速率调查中发现，生长的前期(28 d之前)两者没有显著差异(P>0.05)，从28 d开始转基因菊苣叶片发生速率显著快于野生型(图3B，P<0.05)。对营养生长向生殖生长过渡期间的性状也进行了考察，转基因菊苣的平均抽薹时间为223.1 d，比对照(202.9 d)要晚20.2 d(P<0.05)，开花时间为251.9 d，比对照(224.6 d)要晚27.3 d(图3C，P<0.05)。但相同的生长时间，转基因菊苣的株高相对于野生型有变矮的趋势，但差异没有达到显著水平(图3D)，2014年总共刈割4次测产，每次及年总产草量与对照没有显著差异(P>0.05，图3E)。

图3 AtmiR156a转基因菊苣表型性状调查Fig.3 Phenotypic observations of AtmiR156a transgenic chicory A, B, n=30;C, D, E, n=20.*表示差异在P<0.05达显著水平。*stands for a significant difference at P<0.05 level.

3 讨论

牧草是以营养器官为主要收获目标的作物，通过改变植物的形态、营养生长时间能显著提高植物生物产量[20]，类似的研究在能源草柳枝稷中已经报道[11]。前人通过突变体以及过量表达等研究成功鉴定了许多控制植物形态建成和开花的关键基因，其中，SPL (squamosa promoter binding like)家族基因参与调控植物顶端优势建成与营养生长向生殖生长转变；但是SPL在植物基因组中存在多个同源基因，通过RNAi干涉或者突变很难获得理想效果[21]。SPL基因受miR156的调控，通过上调miR156的表达能够整体上调节SPL家族基因的表达变化，最终调节植物营养生长与形态建成[22-23]。在本研究中，通过在菊苣中过量表达拟南芥的AtmiR156a基因，同样能够推迟抽薹、开花时间，说明在菊苣和拟南芥中，miR156a的结构和功能具有很强的保守性，但是由于菊苣基因组序列信息的限制，没能够进一步分析菊苣SPL家族基因的表达变化。

在拟南芥、水稻以及玉米中都报道miR156过量表达会造成植株矮化等生长发育异常表型[4-5]，对于收获籽实为目标的农业生产中，很难被直接利用。然而，在过量表达miR156的柳枝稷中，植物的形态建成与生物产量与miR156过量表达的程度有关：在一定范围内(1.6～6.4倍)，miR156的表达量与植株生物产量呈显著正相关，但表达量过高会造成植株矮化导致生物产量下降[11]。在本研究中，对生长发育正常的单株进行表型与表达分析，发现AtmiR156a的表达上调了7.9倍，叶片发生速率加快，但植株高度下降，产草量与野生型菊苣基本相当。该结果与前人在水稻、玉米以及柳枝稷中的报道都有不同，造成这种现象的原因可能是因为转化使用的基因为拟南芥来源AtmiR156a，该基因在菊科以及十字花科中功能存在保守性的同时也发生了分化；还有可能是因为用于分析的转基因植株为T1代转基因植物，在T-DNA插入位点还没有纯合，具体原因还有待于后续研究。

菊苣在南方草畜业中主要利用方式为青饲，作为一种优质牧草，其本身蛋白含量较高，纤维素含量较低。过量表达AtmiR156a的菊苣叶片发生速率加快，植株矮化，在一定程度上增加了幼叶比例，提高了营养品质。在实际测定中，确实发现AtmiR156a过量表达的菊苣中蛋白质含量提高了3.7%，纤维素含量降低了2%，然而，这种变化幅度并没有预期的明显，可能与选用的作物本身为优质牧草有关，其本身的蛋白含量较高，而纤维含量较低，整体效果没有禾本科作物明显，因为在Fu等[11]的研究中，大部分转基因柳枝稷中的碳水化合物被糖解酶降解的效率大大提高。

4 小结与展望

通过过量表达AtmiR156a能够显著推迟植株抽薹、开花时间，提高植物营养品质，更加精准的定向遗传改良及其调控机制研究还有待于菊苣基因组(转录组)数据的发掘与高世代纯合遗传转化株系的获得。

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AtmiR156aregulates the vegetative growth and forage quality of chicory (Cichoriumintybus)

LI Xiao-Dong, CAI Lu, ZHANG Yu, WANG Qian, MO Ben-Tian, HAN Yong-Fen, WANG Xiao-Li*

GuizhouInstituteofPrataculture,Guiyang550006,China

Chicory is an important forage plant for animal husbandry in south China. The yield of chicory is closely related to the length of the plants’ vegetative growth phase. In this study,ArabidopsisAtmiR156awas over-expressed in chicory and a total of 140 independent lines of transgenic plants were obtained. PCR analysis detected 94.3% positive expression in these plants. q-PCR analysis showed that, compared with the wild-type chicory used as control, the expression ofAtmiR156awas promoted by 7.9 times in the transgenic plants. Germination rates for theAtmiR156aover-expressed lines were similar to that of the control, but the leaf emergence rate was significantly faster. Bolting time and flowering time were delayed by 20.2 and 27.3 days respectively in theAtmiR156aover-expressed lines. However, plant height was reduced, which led to similar annual forage yields for both the wild type and transgenic plants. Forage quality was analyzed via a first cutting of leaves. The results showed that crude protein content was 3.7% higher and fiber content was 2% lower in theAtmiR156aover-expressed lines; other quality traits showed no significant differences from the control seedlings. Our results establish an efficient method for the genetic transformation of chicory. The experiment also created a pool of late-flowering and fast-growing germplasm resources, laying a foundation for the breeding of high-yield and cutting-resistant chicory varieties. The results provide a reference for theoretical studies and practical applications aiming to improve chicory performance through the use of genes from other crops.

chicory;AtmiR156; vegetative growth; forage quality

10.11686/cyxb2016128

http://cyxb.lzu.edu.cn

2016-03-23；改回日期：2016-05-10

贵州省联合基金项目“利用AtmiR156a培育高产耐刈菊苣种质新材料”(黔科合J字LKN[2013]04号)，贵州主要优良牧草种质资源发掘与创新利用研究农科院自主创新科研专项(黔农科院自主创新科研专项字[2014]010号)和贵州省农业科学院博士启动基金“四倍体菊苣种质创新应用研究”(黔农科院人才启动项目[2013]01)资助。

李小冬(1984-)，男，湖南邵阳人，副研究员，博士。 E-mail: lixiaodongzl@163.com*通信作者Corresponding author. E-mail: wangxiaolizhenyuan@126.com

李小冬, 蔡璐, 张瑜, 王茜, 莫本田, 韩永芬, 王小利.AtmiR156a调控菊苣营养生长与品质. 草业学报, 2016, 25(11): 160-166.

LI Xiao-Dong, CAI Lu, ZHANG Yu, WANG Qian, MO Ben-Tian, HAN Yong-Fen, WANG Xiao-Li.AtmiR156aregulates the vegetative growth and forage quality of chicory (Cichoriumintybus). Acta Prataculturae Sinica, 2016, 25(11): 160-166.