永登枸杞鲜果晾晒过程中霉腐病原真菌的分离鉴定

袁惠君,李虎军,贾鸿震,巩慧玲,冯再平

(兰州理工大学生命科学与工程学院,甘肃兰州 730050)



永登枸杞鲜果晾晒过程中霉腐病原真菌的分离鉴定

袁惠君,李虎军,贾鸿震,巩慧玲,冯再平

(兰州理工大学生命科学与工程学院,甘肃兰州 730050)

以永登枸杞鲜果晾晒过程中产生的霉腐果为材料,分离、纯化、鉴定了导致霉腐病发生的病原真菌。结果表明,枸杞鲜果铺在晒床上2～4 d内出现霉腐病初期症状,发病部位常在果柄端或擦伤处。链格孢(Alternariaalternata)和戴尔凯氏有孢圆酵母(Torulasporadelbrueckii)是导致霉腐病发生的病原真菌。

枸杞,链格孢,戴尔凯氏有孢圆酵母,鉴定

枸杞(LyciumbarbarumL.)是一种在西北地区广泛栽培的、有重要经济价值的多年生落叶灌木,其成熟果实作为一种名贵中药和滋补品[1],已有3000多年的药用和食用历史[2],具有补肾养肝、润肺明目,增强免疫力、防衰老、降血压、降血脂、抗肿瘤、抗氧化等多方面的药用和保健价值,在国内外享有盛誉[3-4]。但是,枸杞鲜果不耐贮藏,常温下3～5 d内即有30%～90%的鲜果霉烂。目前枸杞鲜果采收后主要的加工方法是晾晒干制[5]。由于鲜果晾晒周期较长,一般夏果需要4～5 d,秋果7～9 d才能达到干制成品的要求[5],所以晾晒过程中常发生大面积霉腐,特别在阴雨天温度低、湿度大的情况下,可导致60%～100%霉烂,造成巨大经济损失,已成为制约枸杞产业发展的关键问题之一。研究表明:导致新疆枸杞鲜果采后霉腐的病原真菌主要有青霉属(Penicilliumsp.)、链格孢属(Alternariasp.)、木霉属(Trichodermasp.)、曲霉属的黑曲霉(Aspergillusniger)、黄曲霉(Aspergillusflavus)[6]。由于不同地域的气候、湿度等条件存在差异,同一个作物品种导致霉腐的病原微生物类群可能不同。永登枸杞鲜果干制过程中霉腐病原菌方面的研究未见报道。

本研究分离、鉴定了永登枸杞鲜果晾晒过程中导致霉腐的病原真菌,将为科学防治枸杞果实霉腐,降低枸杞子加工的成本,提高成品品质提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

枸杞霉腐果实 2014年8月采自甘肃省兰州市永登县上川镇枸杞生产合作社晒床,置于无菌安倍瓶中当天运至本校实验室进行处理;次氯酸钠(10%) 上海普瑞生物研究所;无水乙醇(≥99.0%)分析纯(AR) 天津市大茂化学试剂厂;葡萄糖 分析纯(AR),天津市光复科技发展有限公司;琼脂粉 生化试剂(BR),天津市科密欧化学试剂有限公司。

MGC-1000HP-2型人工气候箱 上海一恒科学仪器有限公司;SW-CJ-1FD型超净工作台 吴江市净化设备总厂;GZX-9030MBE型烘箱 上海博讯医疗设备厂;YX-24LDJ型手提式高压灭菌锅 江阴滨江医疗设备有限公司;AB104-N型电子分析天平 梅特勒-托利多仪器有限公司;BCD-551WKM型冰箱 美的集团有限公司;日立HITACHI S-3400N型扫描电镜 日本Hitach公司。

1.2 实验方法

1.2.1 永登枸杞果实霉腐症状及病原菌的分离和纯化 随机选取枸杞鲜果,每10粒一组置于无菌培养皿中,在露天自然通风条件下晾晒2、4、6 d后观察霉腐症状。

病原菌的分离和纯化采用组织分离法[7],选择晾晒3 d病斑典型的发病果实冲洗干净后,在病健交界处剪下5 mm×5 mm的小块组织,先用2%的次氯酸钠表面消毒8 min,无菌水洗5遍,再用75%的酒精消毒30 s,无菌水洗8遍后,移至灭菌培养皿中加1 mL无菌水捣碎,用接种环蘸取含菌组织液在PDA平板上划线,28 ℃培养并挑取单菌落,连续纯化3次后的纯培养物保存于PDA斜面培养基上置于4 ℃冰箱贮存备用[8-9]。

1.2.2 病原真菌的形态学鉴定 将代表菌株分别置于不同的培养基上。霉菌在马铃薯胡萝卜琼脂培养基(PCA)25 ℃下培养5～7 d,酵母菌在麦芽汁琼脂培养基28 ℃下培养3 d,观察记载菌落培养性状。挑取霉菌菌丝和酵母制成水装片,在普通光学显微镜下观察形态;挑取霉菌菌丝和酵母,粘在样品台上,置于液氮中速冻后在扫描电镜下观察孢子、细胞等形态特征。

1.2.3 病原真菌的分子生物学鉴定 将供试菌株接种到PDA培养基上于25 ℃培养3～5 d后送至大连宝生物工程有限公司进行菌株基因组DNA提取、PCR扩增和测序,将所得序列与GenBank核酸数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)进行比对。并用MEGA 5.1进行系统发育分析和进化树构建,用Neighbor joining法构建进化树,自展次数为1000次。

1.2.4 致病性测定 25 ℃条件下,纯化的培养物在PDA培养基上培养3～5 d后用打孔器钻取直径5 mm菌饼备用。挑选健康完整的永登县上川镇枸杞生产合作社生产的枸杞干果,用无菌水浸泡1 h复水模拟晾晒3 d的枸杞果实,用2%的次氯酸钠表面消毒8 min,无菌水洗5遍,再用75%的酒精消毒30 s,无菌水洗8遍后,用无菌解剖针刺伤果实,将直径5 mm菌饼覆盖在伤口处置于无菌培养皿中在25 ℃的培养箱内培养5 d后观察并记载发病情况[10],以伤口处覆盖琼脂饼的果实为对照。

2 结果与分析

2.1 永登枸杞晾晒过程中果实霉腐病症状

从53份发病枸杞果实样品中共分离得到107个菌落。根据菌落特征主要为霉菌和酵母两类真菌,各霉菌菌落形态上没有显著差异,酵母菌菌落为白色。从出现频率来看,霉菌菌落92个,占菌落总数的86%;白色酵母菌菌落15个,占菌落总数的14%。枸杞鲜果干制过程中的霉腐主要发生在鲜果铺在晒床上2～4 d内。发病初期,常在果柄端或擦伤、破皮处长出白色至灰白色菌丝,果实病变部位由鲜红色转为暗红色至黑色(图1B、图1C);严重时病斑不断扩大,深入果实内部,使局部或整粒果实软腐变黑,表面被霉菌菌丝包裹,并扩散感染邻近的健康果实(图1D)。

图1 果实的霉腐病症状Fig.1 Rot symptoms of the Yongdeng barbary wolfberry fruits注:A:永登枸杞鲜果;B:晾晒2 d(B)、 C:晾晒4 d、D:晾晒6 d后果实。

图2 霉腐病原菌链格孢的菌落(A,B)、 分生孢子和分生孢子梗(C,D)形态特征Fig.2 Colony(A,B),conidia and conidiophores (C,D)of the pathogen A. alternata 注:A、B:霉腐病原菌链格孢的菌落; C、D:分生孢子和分生孢子梗。

2.2 病原真菌的形态特征及分子生物学鉴定

从92个霉菌菌落中随机挑选g7菌株和g16菌株作为代表菌株,25 ℃条件下,在PCA培养基上培养5 d形成直径为54～57 mm的圆形菌落。菌落平展,灰色至暗青褐色,表面密绒状,边缘整齐背面灰白色至黑褐色,有同心轮纹(图2A,B)。菌丝有分隔,多分枝;分生孢子梗单生或分枝,直立,直或微弯曲;分生孢子单生或形成短链,倒棒形,卵形,倒梨形或近椭圆形,黄褐色,表面光滑或有微刺,具有3～7个横膈,0～3个纵或斜隔膜,主分隔处不隘缩或略隘缩,孢身长10～40 μm,宽5～12 μm;短喙柱状或锥状(图2C,D)。用 rDNA-ITS区引物对g7和g16菌株进行PCR扩增,得到481 bp的rDNA-ITS序列,与GenBank中收录的序列进行BLAST比对,结果表明:该菌与链格孢(Alternariaalternata)和细极链格孢菌(Alternariatenuissima)的rDNA-ITS序列相似性均达100%,但是细极链格形成超过10个孢子连成的无分支孢子链,而本研究中g7和g16菌株分生孢子单生或形成短链(图2),与链格孢分生孢子形态和产孢表型相符[11]。根据上述菌株的形态特征和ITS序列分析结果(图3),将g7和g16菌株鉴定为链格孢(Alternariaalternata)。

图3 以ITS-rDNA 基因序列 为分子标记的g7和g16菌株系统进化树Fig.3 The phylogenetic tree of g7 and g16 strain based on ITS-rDNA sequence

链格孢寄主范围广泛,是多种鲜果采后贮藏期间的病原菌[12-14]。兰璞等[6]的研究结果表明链格孢属(Alternariasp.)真菌是导致新疆枸杞采后霉腐病的主要病原菌之一,与本研究结果相符。链格孢属(Alternariasp.)真菌也是宁夏枸杞(Lyciumbarbarum)茎和果实内生真菌的优势种群[15-16]。干制过程中可能由于温度、湿度、创伤、离体果实抗病能力下降等原因,引发链格孢快速生长,导致霉腐病爆发,揭示其中的机理将为下一步有效地控制病原菌的生长繁殖、抑制病害发生、提高枸杞子品质提供理论依据。

从形成白色酵母菌菌落的菌株中随机挑选g22W菌株为代表在28 ℃、麦芽汁琼脂培养基上培养2 d形成直径为0.5～1 cm的白色菌落,表面凸起,光滑,不透明;油镜和扫描电镜下单个菌体均为球形或近球形,直径约2.5～5 μm,多边芽殖(图4)。用rDNA-ITS区引物进行PCR扩增,得到该菌株717 bp的rDNA-ITS序列,与GenBank中收录的戴尔凯氏有孢圆酵母菌(Torulasporadelbrueckii)rDNA-ITS序列进行BLAST比对,序列相似度均达99%～100%。根据上述形态和分子生物学特征(图5),将g22W菌株鉴定为戴尔凯氏有孢圆酵母(Torulasporadelbrueckii)。

图4 霉腐病原菌戴尔凯氏有孢圆酵母的 菌落(A)和细胞(B,C)形态Fig.4 Colony(A)and cell morphology(B,C)of the pathogen T. delbrueckii

图5 以ITS-rDNA 基因序列为 分子标记的g22W菌株系统进化树Fig.5 The phylogenetic tree of g22W strain based on ITS-rDNA sequence

枸杞鲜果富含多糖类物质[1,4],擦伤、破皮处和果肉暴露在空气中的果柄端都极易受酵母菌侵染,导致果实发酵腐坏。

2.3 致病性测定

用针刺法接种病原真菌5 d后,果实伤口处均发病。在接种链格孢的针孔处形成圆形灰黑色小菌落,果实病变部位由鲜红色转为暗红色至黑色(图6);在接种戴尔凯氏有孢圆酵母的针孔处形成白色酵母菌菌落(图6)。在接种部位取发病组织分离纯化后再次获得了接种菌。根据柯赫氏法则,表明链格孢(Alternariaalternata)和戴尔凯氏有孢圆酵母(Torulasporadelbrueckii)是永登枸杞晾晒过程中果实霉腐病的致病菌。

图6 针刺法接种病原真菌后伤口发病情况Fig.6 Symptoms of the diseased fruit after inoculation

3 结论

本研究结果表明,永登枸杞鲜果在晾晒过程中的霉腐病主要在鲜果铺床后2～4 d内发生,发病部位常在果柄端或擦伤、破皮处,并能扩散感染邻近的健康果实。链格孢(Alternariaalternata)和戴尔凯氏有孢圆酵母(Torulasporadelbrueckii)是永登枸杞鲜果在晾晒过程中导致霉腐病发生的病原真菌。链格孢菌能产生毒素[17],本研究中从枸杞霉腐果中分离的链格孢菌是否产生毒素及其对人体的危害有待进一步研究,但具有潜在的食品安全风险。戴尔凯氏有孢圆酵母是果酒酿造中的常见酵母,能影响果酒的香气[18-19],但在枸杞鲜果晾晒中出现可能影响枸杞子成品风味和营养价值。因此,应当全面制定在枸杞鲜果干制过程中主要霉腐菌污染的限量指标,保证食品安全和品质。

[1]杜毅,高华,班长俊,等. 枸杞的化学与药理研究新进展[J]. 内蒙古中医药,2000,19(4):40-41.

[2]张秀云,利锐,周凤琴.枸杞子本草考证[J].山东中医药大学学报,2014,38(2):124-126.

[3]刘云婷,徐巍,辛毅,等.枸杞子提取物对小鼠肠道菌群失衡的调整作用[J].天然产物研究与开发,2015,(7):1270-1272.

[4]陈清华,王朝良.宁夏枸杞产业发展优势和提升出口竞争力的对策[J].农业现代化研,2008,29(2):151-154.

[5]章中.枸杞保藏加工技术现状[J].中国食物与营养,(5):31-33. 2008。

[6]兰璞,高芙蓉,陈存坤,等.枸杞采后病害及主要病原真菌的分离与鉴定[J].中国果蔬,2014,34(12):9-12.

[7]谢昌平,谭翰杰,张能,等.斐济金粽叶斑病菌鉴定及生物学特性[J].植物保护,2009,35(2):67-71.

[8]刘亚亚,陈垣,郭凤霞,等.掌叶大黄根腐病病原菌的分离与鉴定[J].草业学报,2011,20(1):199-205.

[9]林武镇,廖富荣,陈细红,等.火龙果细菌性软腐病菌的分离与鉴定[J].植物病理学报,2015,45(2):220-224.

[10]章武,刘国道,南志标.4种暖季型草坪草币斑病病原菌鉴定及其生物学特性[J]. 草业学报,2015,24(1):124-131.

[11]张天宇.中国真菌志:链格孢属[M].北京:科学出版社,2003:1-220.

[12]Greco M,Patriarca A,Terminiello L,et al. Toxigenic Alternaria species from Argentinean blueberries[J]. Toxigenic Alternaria species from Argentinean blueberries. International Journal of Food Microbiology,2012,154(3):187-191.

[13]Prusky D,Shalom Y,Kobiler I,et al. The level of quiescent infection of Alternaria alternata,in mango fruits at harvest determines the postharvest treatment applied for the control of rots during storage[J]. Postharvest Biology & Technology,2002,25(3):339-347.

[14]Li Y C,Bi Y,An L Z. Occurrence and latent infection of Alternaria Rot of Pingguoli pear(Pyrus bretschneideri,Rehd. cv. Pingguoli)fruits in Gansu,China[J]. Journal of Phytopathology,2007,155(1):56-60.

[15]刘建利.宁夏枸杞内生真菌的分离及抗氧化活性的测定[J].时珍国医国药,2011,22(4):857-860.

[16]祁鹤兴,贾倩,高媛,等.宁夏枸杞果内生真菌多样性及其分布[J].北方园艺,2015,(13):153-157.

[17]Tsuge T,Harimoto Y,Akimitsu K,et al. Host-selective toxins produced by the plant pathogenic fungus Alternaria alternata[J]. Fems Microbiology Reviews,2013,37(1):44-66.

[18]Loira I,Vejarano R,Bauelos M A,et al. Influence of sequential fermentation with Torulaspora delbrueckii and Saccharomyces cerevisiae on wine quality[J]. Lebensmittel-Wissenschaft und-Technologie,2014,59(2):915-922.

[19]付俊淑,庄世文,徐丹丹,等. 酵母分离株分子鉴定及其挥发性香气成分检测分析[J]. 食品与发酵工业,2010(2):44-48.

Isolation and identification of the pathogen causing mildew rot of the Yongdeng barbary wolfberry in the air-drying process

YUAN Hui-jun,LI Hu-jun,JIA Hong-zhen,GONG Hui-ling,FENG Zai-ping

(College of Life Science and Engineering,Lanzhou University of Technology,Lanzhou 730050,China)

Thepathogen,causingYongdengbarbarywolfberrymildewrotintheair-dryingprocess,wasisolatedfromdiseasedfruits.Theresultsshowedthatinitialsymptomsofthediseaseappearedwhenfruitswasputonbamboomattwoorfourdayslater.Themainpathogenicsiteswascarpopodiumsidesorscratches.Basedontheresultofpathogenicitytesting,Alternaria alternataandTorulaspora delbrueckiiwasthepathogenofYongdengbarbarywolfberrymildewrot.

barbarywolfberry;Alternaria alternata;Torulaspora delbrueckii;identification

2016-05-10

袁惠君(1974- )，女，硕士，副教授，主要从事果蔬生理及抗逆性研究，E-mail:gsyhj@163.com。

兰州市科技发展计划项目(2012-2-161) ；国家自然科学基金(31460629) 。

TS255.36

A

1002-0306(2016)21-0135-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.21.018