绿茶天然茶汤纳米聚集体的分离与分析

李 斌,康雨婷,陈忠正,张媛媛,罗 维,林晓蓉

(华南农业大学食品学院,广东广州 510642)



绿茶天然茶汤纳米聚集体的分离与分析

李 斌,康雨婷,陈忠正,张媛媛,罗 维,林晓蓉*

(华南农业大学食品学院,广东广州 510642)

为建立快速、有效分离天然茶汤纳米聚集体的方法,分析其基本理化组成,本研究以茶水比1∶50的云南大叶种绿茶汤为材料,采用超滤离心技术分离茶汤纳米胶粒,利用动态光散射和激光多普勒测速技术分析其直径、表面电荷等物理化学特性,比较超滤膜孔径、离心力、离心时间对胶粒分离效果的影响;利用高效液相色谱等技术分析其茶多酚等理化组分的浓度、比例等分布特性。结果表明:绿茶天然茶汤(25 ℃)存在大量平均直径约300 nm、表面带负电荷的纳米聚集体,其可经截留分子量为100 ku的超滤膜、4000×g离心20 min成功分离,该胶粒以蛋白质、可溶性糖和茶多酚为主体成分,各儿茶素、生物碱等单体均参与其理化构成。结论:超滤离心技术是快速分离绿茶天然茶汤纳米聚集体的有效手段,该胶粒以蛋白质、可溶性糖和茶多酚为主要组分。

绿茶,纳米聚集体,超滤,物理化学特性,理化组成

茶叶[Camelliasinensis(L). O. Kuntze]起源于中国,被誉为“大自然赐予人类的天然保健饮料”,具有预防肿瘤、心血管、代谢综合症和神经组织退化疾病等健康功效[1]。茶多酚、生物碱等是茶叶功效发挥的化学基础,其单一组分的功能活性及其作用机制等已广泛大量研究[2]。然而在天然茶汤中,茶多酚、生物碱等组分间并非完全以游离化合物的形式存在,各组分的分子间存在复杂的相互作用[3-5]。纳米聚集体是化合物分子自发结合形成的纳米级胶粒,广泛存在于药物、中药、食物等单组份或多组分体系,具有强化多组分协同增效/拮抗竞争等相互作用[6]、非特异性吸附可溶性蛋白质、可逆抑制酶活性等特性[7],且与化合物的生物利用率、靶向运输等有关[8],已成为当前中药、食物等多组分综合功能特性研究的新方向[9-11]。早在1995年,Gröning等已证实红茶天然茶汤存在大量平均直径为200 nm、表面带负电荷的球型纳米聚集体[12]。2014年,Yi等首次利用截留分子量(MWCO,molecular weight cut-off)为300 ku的透析袋从绿茶汤分离获得直径100～300 nm、表面带负电荷的纳米胶粒,并指出该胶粒以蛋白质和糖为主体成分、不含儿茶素与生物碱[13]。但该研究所采用的长时间纯水透析很可能导致一些结合作用较弱的组分游离出来,难以还原绿茶天然茶汤纳米聚集体的真实特性,限制了对茶汤纳米聚集体的形成机制与功能特性等深入研究。目前,纳米聚集体的分离方法主要包括以胶粒尺寸大小为分离依据的凝胶色谱、超滤、透析、场流分离色谱等技术,以及根据胶粒的比重实现分离的高速、超速离心等方法。其中,超滤离心技术以其效率高、耗时短、不易因稀释效应而改变胶粒组成等优势,已成功运用于分离复方中药麻杏石甘汤的纳米聚集体[14]。

为建立快速、有效的天然茶汤纳米聚集体分离方法,分析茶汤纳米聚集体的基本理化组成,本研究以云南大叶种绿茶为原料,采用超滤离心技术分离茶汤(茶水比1∶50)纳米聚集体,采用DLS、激光多普勒测速(LDV,laser Doppler Velocimetry)技术分析纳米聚集体的总光强、平均直径、Zeta电位和电导率等物理化学参数,比较超滤膜孔径、离心力、离心时间对纳米聚集体分离效果的影响,确定茶汤纳米聚集体的超滤离心分离条件;在此基础上,采用高效液相色谱(HPLC,high performance liquid chromatography)、紫外可见光谱等技术系统分析茶汤茶多酚、蛋白质、可溶性糖、儿茶素、生物碱等组分在纳米聚集体的分布特性,初步探讨纳米聚集体的理化组成特性,以期为深入研究茶汤纳米聚集体的形成机制与功能特性提供必要的技术方法与初步的理论研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

云南大叶种蒸青绿茶 广东省华海糖业发展有限公司,磨碎筛取20～30目粒径茶样;表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG,≥95%)、表儿茶素没食子酸酯(ECG,≥98%)、表没食子儿茶素(EGC,≥98%)、表儿茶素(EC,≥98%)、没食子儿茶素没食子酸酯(GCG,≥98%)、儿茶素没食子酸酯(CG,≥98%)、没食子儿茶素(GC,≥98%)、儿茶素(C,≥98%)、茶碱(TP,≥99.0%)、可可碱(TB,≥99.0%)、色谱纯甲酸(≥98%) Sigma-Aldrich(上海)贸易有限公司;咖啡碱(CAF,99.9%) 上海生工生物工程有限公司;色谱纯甲醇 美国Spectrum公司;福林酚试剂(2 mol/L)、牛血清蛋白组分Ⅴ 北京普博欣生物科技有限公司;实验用水 Milli-Q超纯水(电阻率≥18.2 MΩ·cm,电导率约为0.055 μS/cm)。

Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)、Agilent 1200高效液相系统(包括G1322A真空脱气装置、G1311A四元泵、G1329A标准自动进样器及G1315D二极管阵列检测器) 美国Agilent公司;Milli-Q Integral 3超纯水系统、Amicon Ultra-4离心过滤器(PES滤膜) Merk-Millipore公司;Centrifuge 5804R冷冻离心机 德国Eppendorf A G公司;UV-2102C紫外可见分光光度计 上海尤尼科有限公司;Zetasizer Nano ZS 90纳米粒度仪 英国Malvern公司。

1.2 实验方法

1.2.1 茶叶浸提与纳米聚集体分离 称取适量磨碎绿茶样,按1∶50茶水比加入100 ℃预热超纯水,沸水浴浸提30 min,浸提结束后,定量滤纸分离茶渣,茶汤冷却备测。

取4 mL茶汤,按如下操作分离纳米聚集体:采用MWCO为3、10、100 ku的超滤膜,以4000×g离心20 min,并以相同离心条件的常速离心为对照;采用MWCO为100 ku的超滤膜,以1000、2000、3000、4000×g离心20 min;采用MWCO为100 kDa超滤膜,以4000×g离心10、20、30、40 min。收集上清、纳米聚集体部分,茶汤、上清稀释2倍,备测。

1.2.2 纳米聚集体物理化学特性分析 参考Lin等方法[15],采用DLS、LDV技术(25 ℃)测定绿茶的原始茶汤及纳米聚集体的总光强、平均水合直径(DH,hydrodynamic diameter)和Zeta电位值、电导率。体系总光强是胶粒直径与数目的综合体现,在相同条件下,体系总光强与胶粒直径六次方成正比,与胶粒数目成正比,即胶粒直径越大、粒子越多,总光强越大。胶粒Zeta电位的正负号代表胶粒表面所带正电荷或负电荷,但无论是正或负电荷,Zeta电位越大、胶粒间静电排斥作用越强、胶粒越稳定。电导率反映体系带电离子的浓度。

1.2.3 纳米聚集体理化组成分析 参考Lin等方法[15],茶汤、上清和纳米聚集体的茶多酚浓度采用福林酚试剂比色法测定,可溶性蛋白质浓度采用Bradford考马斯亮蓝G-250比色法测定,可溶性糖浓度采用硫酸-蒽酮比色法测定。茶汤等样液经0.45 μm膜过滤后,采用HPLC技术测定其EGCG、ECG、EGC、EC、GCG、CG、GC、C等8种儿茶素单体和咖啡碱、可可碱、茶碱3种生物碱单体浓度,采用Eclipse XDB-C18色谱柱(4.6 nm×250 nm,5 μm)进行分离,柱温为40 ℃,以纯甲醇(A)和pH2.5、0.2%甲酸(B)为流动相进行梯度洗脱(0～25 min,流动相A比例由19%升至44%),流速为1.0 mL/min,进样量为5 μL,检测波长为280 nm,采用外标法计算各组分浓度。

根据同一理化组分在茶汤纳米聚集体的分布浓度占其原始茶汤浓度的比例计算其分布比例,以同一组份在原始茶汤的浓度为100%,依次扣除其在常速离心和MWCO为100、10、3 ku的超滤膜所截留纳米聚集体的分布比例,分析各组分在不同粒径范围的纳米聚集体的分布特性。

1.2.4 数据分析 所有实验含3次平行,重复2次以上,实验数据以平均值±标准偏差表示。采用SAS 9.0统计软件,根据Fisher最小显著性差异法进行多重比较,分析各样品的组间差异显著性,组间差异显著者用不同上标字母表示(p<0.05),并按字母次序依据数值由大到小编号,相同字母表示组间差异不显著。

2 结果与分析

2.1 超滤膜孔径对纳米聚集体分离效果的影响

超滤膜孔径是决定超滤离心技术选择性分离纳米胶粒的关键因素,为探究超滤膜孔径对绿茶纳米聚集体的分离效果,本研究首先比较绿茶的原始茶汤及其经MWCO为3、10、100 ku超滤膜离心处理、相同离心条件的常速离心处理所得上清的总光强,结果如图1所示。

图1 绿茶汤经常速离心、超滤离心前后的总光强Fig.1 Total intensity of green tea infusions with or without centrifugation and ultrafiltration assisted with centrifugation

由图1可知:经常速离心后,绿茶原始茶汤总光强下降近30%,说明绿茶部分纳米胶粒可经常速离心分离;但经超滤离心处理后,绿茶汤总光强降低幅度超过99%,MWCO为3、10、100 ku的超滤膜处理后,上清的总光强依次为2.5、2.7、5.2 kcps,说明超滤离心可分离绿茶汤绝大部分纳米聚集体。

为进一步比较不同孔径超滤膜对绿茶纳米胶粒的分离效果,本文分析了原始茶汤和常速离心、超滤离心分离所得纳米胶粒的总光强和平均直径,结果如图2所示。

图2 绿茶原始茶汤及其常速离心、超滤离心所得 纳米胶粒的总光强、平均直径(A)和Zeta电位、电导率(B)Fig.2 Total intensity and average diameter(A)and Zeta potential and conductivity(B)of nano-colloidal particles separated via centrifugation or ultrafiltration assisted with centrifugation from green tea infusions

由图2A可知:原始茶汤纳米聚集体的平均直径约300 nm,经常速离心分离所得的纳米胶粒的平均直径显著增大,超过原始茶汤纳米聚集体平均直径的3倍,但其总光强仅为原始茶汤的25%。说明常速离心所得纳米胶粒的直径大、但数量极少,只能分离茶汤中少量平均直径约900 nm的大粒子。采用超滤离心分离所得纳米聚集体的平均直径与原始茶汤相当,但其中仅MWCO为100 ku的超滤膜所分离纳米聚集体的总光强与原始茶汤无显著差异,说明采用MWCO为100 ku的超滤膜能较完全分离在绿茶原始茶汤中占主体的纳米聚集体,且超滤过程不易引起胶粒间聚集等变化。

由图2B可知:原始茶汤纳米聚集体表面带负电荷,其Zeta电位约-20 mV;采用常速离心和MWCO为100 ku超滤膜离心所得纳米胶粒的Zeta电位均超过-30 mV,显著高于原始茶汤,但两种处理间无显著差异;采用MWCO为10、3 ku超滤膜离心所得胶粒的Zeta电位值均显著高于原始茶汤,但均不超过-25 mV;超滤膜孔径越大,其所截留纳米聚集体的Zeta电位值越大。原始茶汤的电导率约1.02 mS/cm,但常速离心所得纳米胶粒的电导率不到其2%;超滤离心分离的纳米胶粒电导率均显著低于原始茶汤、高于常速离心所得胶粒,且超滤膜孔径越大,其截留纳米胶粒的电导率越小。结合Zeta电位和电导率分析,初步说明绿茶原始茶汤的Zeta电位是由其带负电荷的纳米聚集体和上清部分带电离子的共同体现,采用MWCO为100 ku的超滤膜可有效分离茶汤纳米聚集体,减少上清带电离子的干扰。

上述结果说明,MWCO为100 ku的超滤膜比3、10 ku的超滤膜更适于分离绿茶天然茶汤纳米聚集体,后续实验均采用此孔径的超滤膜。本团队前期分析发现,绿茶沉淀颗粒的平均直径为(910.50±100.76) nm、Zeta电位为(-26.67±0.79) mV[16],说明本研究中常速离心分离的纳米胶粒主要是沉淀颗粒。

2.2 离心力对纳米聚集体分离效果的影响

离心是本研究中超滤膜截留绿茶纳米聚集体的主要动力,故离心力的大小会直接影响茶汤纳米聚集体的分离效果,但本文所用超滤离心装置只能承受不超过4000×g的离心力。因此,为探究离心力对绿茶纳米聚集体分离效果的影响,本论文采用MWCO为100 ku的超滤膜,以1000、2000、3000、4000×g离心20 min,处理绿茶汤,比较超滤离心所得纳米胶粒的总光强、平均直径和Zeta电位、电导率,结果如图3所示。

图3 绿茶汤经不同离心力超滤离心所得纳米胶粒的 总光强、平均直径(A)和Zeta电位、电导率(B)Fig.3 Total intensity and average diameter(A)and Zeta potential and conductivity(B)of nano-colloidal particles separated via ultrafiltration assisted with different centrifugal forces

由图3A可知:离心力由1000×g增至2000×g时,所得纳米胶粒的总光强显著增大、但平均直径无显著变化,说明将离心力由1000×g增大至2000×g可显著提高所分离纳米胶粒的数目;继续增大离心力,胶粒总光强和平均直径均无显著变化。由图3B可知:随离心力由1000×g增至2000×g,所分离胶粒的Zeta电位值显著增大;但继续增大离心力至3000×g,胶粒Zeta电位值无显著变化;当离心力增至4000×g时,胶粒Zeta电位值达到最大。随离心力增大,纳米胶粒的电导率逐渐减小。上述结果说明,离心力不低于2000×g时,均可分离获得在原始茶汤中占主体的纳米聚集体,但仅当离心力达到4000×g时,才能有效去除上清带电离子的干扰。因此,后续实验采用4000×g为超滤处理的离心力。

2.3 离心时间对纳米聚集体分离效果的影响

在初步确定超滤膜孔径、离心力基础上,为进一步分析离心时间对绿茶纳米聚集体分离效果的影响,本文采用MWCO为100 ku的超滤膜,固定离心力为4000×g,比较离心时间为10、20、30、40 min条件下,所分离绿茶纳米胶粒的总光强、平均直径和Zeta电位、电导率,结果如图4所示。

图4 绿茶汤经不同超滤离心时间所得纳米胶粒的 总光强、平均直径(A)和Zeta电位、电导率(B)Fig.4 Total intensity and average diameter(A) and Zeta potential and conductivity(B)of nano-colloidal particles separated via ultrafiltration assisted with centrifugation for different time

由图4A可知:当离心时间由10 min延长至20 min时,所分离绿茶汤纳米胶粒的总光强和平均直径均显著提高;继续延长离心时间至30 min,纳米胶粒总光强无显著变化,但其平均直径显著减小,说明所分离纳米胶粒的数量增多,这可能与离心时间过长、导致少量纳米胶粒解聚有关,但具体机制仍需要进一步验证;继续将离心时间由30 min延至40 min,纳米胶粒总光强和平均直径均无显著变化。由图4B可知,随离心时间延长,纳米胶粒的Zeta电位值显著增大、电导率显著减小,说明延长离心时间有利于去除所分离纳米胶粒中的带电离子。综合图4A和4B的实验结果,为快速分离茶汤纳米胶粒,后续实验固定离心时间为20 min。

2.4 绿茶主要理化组分在纳米聚集体的分布特性

纳米聚集体是茶汤各理化组分自发分子结合的结果,在上述物理化学分析的基础上,为从植物化学角度初步探讨绿茶天然茶汤主要理化组分在不同孔径超滤膜所分离的纳米聚集体中的分布特性,本文分析并比较常速离心和三种不同MWCO超滤膜分离所得纳米胶粒中茶多酚、酯型儿茶素、非酯型儿茶素、生物碱、蛋白质、可溶性糖等理化组分的浓度,并在此基础上计算绿茶原始茶汤(100%)各组分分布于各组纳米聚集体的比例,结果如图5所示。

图5 绿茶汤经常速离心、超滤离心所得纳米聚集体中 主要理化组分的浓度(A)及分布比例(B)Fig.5 Concentrations(A)and percentages(B)of major chemicals in green tea infusions distributed in their nano-aggregates separated via centrifugation or ultrafiltration assisted with centrifugation

由图5A可知:常速离心分离所得纳米聚集体中茶多酚等理化组分浓度最低,随超滤膜MWCO减小,所截留纳米聚集体中茶多酚等理化组分浓度逐渐增大;除采用MWCO为3 ku超滤膜截留的纳米聚集体蛋白质浓度与原始茶汤相当外,其他各处理的蛋白质浓度和所有超滤、离心处理的其他组分浓度均显著低于原始茶汤。各处理所截留纳米聚集体的理化组成不同于原始茶汤,原始茶汤各组分浓度大小依次为:茶多酚>酯型儿茶素>非酯型儿茶素>生物碱>蛋白质>可溶性糖,但经常速离心和超滤处理所得纳米聚集体中蛋白质、可溶性糖的比重逐渐增大,且随超滤膜MWCO增大、该特性越突出,而经常速离心分离的纳米聚集体蛋白质浓度更高于茶多酚浓度。

由图5B可知:绿茶各理化组分在采用常速离心、不同孔径超滤膜分离的纳米聚集体中,均以蛋白质的分布比例最高,其次是可溶性糖,茶多酚、儿茶素、生物碱等组分分布在各组纳米聚集体的比例相对较低。以MWCO为100 ku超滤膜分离的占绿茶汤主体的纳米聚集体中,各组分的分布比例均未超过20%,说明茶水比为1∶50的绿茶汤中仅部分理化组分参与其主体纳米聚集体的形成,大部分理化组分分布在粒径更小的胶粒、或以游离分子形式存在。

超滤膜孔径大小的差异是选择性分离茶汤不同粒径纳米聚集体的前提,但孔径较小的超滤膜所分离的纳米聚集体必然包含大孔径超滤膜分离的那部分胶粒,因此,为初步分析绿茶主要理化组分在不同粒径纳米聚集体的分布特性,本文在上述分析基础上,在不同孔径超滤膜分离的纳米聚集体中,减去各组分分布于常速离心所分离的沉淀颗粒及更大一级孔径的超滤膜所截留纳米胶粒的部分,初步比较绿茶原始茶汤中各组分在各粒径范围纳米聚集体的分布比例,结果如表1所示。

由表1可知:茶多酚、酯型儿茶素、非酯型儿茶素、生物碱在各粒径纳米聚集体的分布特性类似,均主体分布在直径约3～30 nm的小粒子部分;其次是小于3 nm部分(包括以游离形式的化合物);其分布于占茶汤主体的直径约30～900 nm的纳米聚集体的比例均不到10%;而分布在常速离心分离所得的直径大于900 nm的沉淀颗粒的比例最低(≤2.5%)。蛋白质主体分布于直径约3～30 nm的纳米聚集体,但其超过20%分布在茶汤主体纳米聚集体和沉淀颗粒部分,分布在直径小于3 nm部分的比例最低。可溶性糖主体分布于直径3～30 nm的纳米聚集体,其次分布于直径30～900 nm的纳米聚集体和直径小于3 nm部分,分布于沉淀颗粒的比例较低。

表1 绿茶主要理化成分在茶汤 各部分纳米胶粒的分布比例(%)Table 1 Percentages of major chemicals in green tea infusions distributed in their nano-aggregates of different diameter(%)

注:MWCO为10 ku的超滤膜,其截留孔径约1 nm,理论上可截留直径大于3 nm的胶粒;MWCO为100 ku的超滤膜,其截留孔径约10 nm,理论上可截留直径在30 nm以上的胶粒。

上述结果说明,茶水比为1∶50的绿茶汤中,茶多酚等理化组分均主体分布在直径约3～30 nm的小粒子中,蛋白质、可溶性糖和茶多酚对占茶汤主体的直径约30～900 nm的纳米聚集体形成可能起关键作用,但儿茶素、生物碱等小分子组分均参与绿茶纳米聚集体的构成。本研究结果与Yi等采用透析法分离所得绿茶纳米聚集体的理化组成存在明显差异,该研究发现绿茶纳米聚集体主要含蛋白质(54%)和可溶性糖(19%),并未检测到儿茶素、生物碱[13]。本团队采用相同透析条件处理云南大叶种绿茶(茶水比1∶50),茶汤纳米聚集体的茶多酚随纯水透析时间延长而逐渐游离到透析袋外部,透析24 h后,被截留的茶多酚仅剩不到2.5%,说明绿茶天然茶汤中的茶多酚等小分子组分很容易在长时间的纯水透析中游离出来,这可能是Yi等经纯水透析72 h所分离绿茶纳米聚集体中未检测到儿茶素和生物碱的主要原因。

3 结论

本研究初步证实茶水比为1∶50的绿茶天然茶汤中,存在大量平均直径约300 nm、表面带负电荷的纳米聚集体,并利用超滤离心技术(MWCO为100 ku的超滤膜,4000×g离心20 min)成功分离该纳米胶粒,揭示其以茶多酚、蛋白质和可溶性糖为主体成分,儿茶素、生物碱等组分亦参与该纳米聚集体的构成,为未来深入探究天然茶汤纳米聚集体的形成机制与功能特性提供技术保障和前期研究基础。

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Separation and characterization of spontaneously assembled nano-aggregates in natural green tea infusions

LI Bin,KANG Yu-ting,CHEN Zhong-zheng,ZHANG Yuan-yuan,LUO Wei,LIN Xiao-rong*

(College of Food Science,South China Agricultural University,Guangzhou 510642,China)

Forthefastandefficientseparationofspontaneouslyassemblednano-aggregatesfromnaturalteainfusionsandforthepreliminarycharacterizationoftheirphysicochemicalandphytochemicalprofiles,ultrafiltrationwasperformedtoseparatenano-aggregatesnaturallyexistedingreenteainfusionsof1∶50tea-waterratiofromCamellia sinensis,assistedwithcentrifugation.Initially,theimpactsofmolecularweightcut-offofultrafiltrationmembranes,centrifugalforcesandcentrifugaltimeonthescatteringintensity,averagediameterofteanano-aggregatesseparatedwereanalyzedbydynamiclightscattering,whiletheirZetapotentialsandconductivitiesweredeterminedvialaserDopplerVelocimetry.Onthisbasis,teapolyphenols,proteins,carbohydrates,catechinsandmethylxanthinesinnano-aggregatesseparatedwithultrafiltrationmembranesofdifferentMWCOweredetectedwithhighperformanceliquidchromatographyandultravioletandvisiblespectrophotometer,inordertoelucidatethechemicalcompositionofgreenteanano-aggregatesandtocharacterizethedistributionfeaturesofvariouschemicalcomponentsinnano-aggregates.Alargenumberofnegatively-chargednano-aggregatesof300nmindiameterwereconfirmedindrinkablegreenteainfusionsat25 ℃.Inaddition,thesecolloidalparticlesweresuccessfullyobtainedbyultrafiltrationmembranesof100kuinMWCOassistedwithcentrifugationof4000×gfor20min.Furthermore,proteins,carbohydratesandteapolyphenolswereindicatedtoconstructthemainbodyofgreenteanano-aggregates,thoughcatechinsandmethylxanthineswerealsofoundintheseparticles.Inconclusion,acombinationbetweenultrafiltrationandcentrifugationprovidedaneffectivemethodfortheseparationofgreenteanano-aggregates.Thesepeculiarnano-colloidalparticleswerecomposedofteapolyphenols,proteinsandcarbohydrates.

greentea;nano-aggregates;ultrafiltration;physicochemicalcharacteristics;chemicalcomposition

2016-05-10

李斌(1960-)，女，博士，教授，研究方向：茶饮料加工与饮料植物功能活性研究，E-mail:bli@scau.edu.cn。

*通讯作者:林晓蓉(1986-)，女，博士，讲师，研究方向：茶饮料加工与茶叶多组分互作研究，E-mail:xiaoronglin@scau.edu.cn。

农业部现代茶叶产业技术体系专项资金(CARS-23)；高等学校博士学科点专项科研基金联合资助项目(20124404110015)。

TS201.2

A

1002-0306(2016)21-0105-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.21.012