不同pH对嗜酸乳杆菌分选酶相关基因表达及菌体黏附能力的影响

王 刚,吴 振,彭刘杨,潘道东,2,*,王文文,曾小群

(1.宁波大学浙江省动物蛋白食品精深加工技术重点实验室,浙江宁波 315211;2.南京师范大学食品科学与营养系,江苏南京 210097)



不同pH对嗜酸乳杆菌分选酶相关基因表达及菌体黏附能力的影响

王 刚1,吴 振1,彭刘杨1,潘道东1,2,*,王文文1,曾小群1

(1.宁波大学浙江省动物蛋白食品精深加工技术重点实验室,浙江宁波 315211;2.南京师范大学食品科学与营养系,江苏南京 210097)

为探究嗜酸乳杆菌在小肠中黏附调控机制,嗜酸乳杆菌黏附与细胞壁分选酶及其相关蛋白的基因表达之间的关系。实验构建体外模型研究了不同pH培养条件下嗜酸乳杆菌的黏附能力、测定了分选酶基因和分选酶相关蛋白基因相对表达差异。实验结果表明:在pH5.5～7.5培养条件下,随着pH升高嗜酸乳杆菌菌体黏附性显著增加,srt基因及其相关蛋白的基因表达量显著上调。研究结果为pH对嗜酸乳杆菌的黏附效应的影响机制提供了相关理论依据。

嗜酸乳杆菌,pH,黏附性,分选酶,表达差异

乳酸菌被广泛应用于发酵食品中,尤其是酸乳、泡菜等[1-2]。乳酸菌作为一类重要的肠道定植型益生菌,能够促进、维护人体肠道健康。乳酸菌的黏附一方面可以通过竞争性占位形成生物屏障,阻止病原菌与肠黏膜和上皮细胞的结合[3-5];另一方面可以提高乳酸菌在宿主体内的驻留时间,有助于乳酸菌的益生功能发挥[6]。乳酸菌的益生性,主要通过平衡宿主肠道内的微生物群落,提高机体利用乳糖的能力,增强机体对肠道内胆汁的耐受性等方面,来提升机体的免疫功能[7-9]。目前研究主要认为菌体表面黏附蛋白对乳酸菌的黏附有重要影响。关于pH对乳酸菌黏附差异的研究目前主要集中在表面凝聚力和疏水性方面,而对黏附蛋白影响研究较少。

菌体黏附功能发挥需要黏附蛋白的参与,其中分选酶相关黏附蛋白(Sortase-dependent proteins,SDPs)主要包括黏液黏附蛋白(Mucus binding protein,mub),甘露糖特异性黏附蛋白(Mannose-specific adhesin,msa),脂蛋白信号肽酶(Lipoprotein signal peptidase,lspA)在黏附中发挥重要作用[10-11]。这类菌体表面蛋白在菌体细胞壁上的锚定过程,需要这类与膜结合的分选酶(Sortase,Srt)催化完成[12-14]。这类蛋白具有保守的C端信号肽LPXTG的表面蛋白,分选酶负责酶切苏氨酸和甘氨酸(TG)之间的肽键,然后将表面蛋白中暴露的苏氨酸末端与肽聚糖肽桥结构中的氨基酸催化形成肽键,从而将分选酶相关的蛋白锚定在菌体细胞壁上发挥黏附作用[15-18]。研究发现鼠李糖乳杆菌中与Srt酶相关的含有LPXTG肽段的蛋白在其定植到肠道中起到重要作用[6];植物乳杆菌中的mub蛋白可以帮助其驻留肠道及在宿主肠道与致病菌形成竞争性占位[19]。还有研究将分选酶srt基因敲除后,缺失的分选酶基因的乳酸杆菌、金黄色葡萄球菌等用于动物模型毒力检测时,出现了毒力减弱的现象[20-21]。

图1 分选酶催化G+菌表面蛋白锚定的过程[15]Fig.1 The process of Sortase catalyzed surface protein anchoring in Gram-positive bacteria[15]

目前研究证明嗜酸乳杆菌可以通过胃部酸性环境进入小肠[22],食物和嗜酸乳杆菌进入小肠后长时间小肠环境对嗜酸乳杆菌的黏附性影响还不清楚。小肠道环境呈弱碱性(pH7.4～7.6),当机体肠道出现炎症及溃疡等疾病时pH会降低,肠道功能发生紊乱[23]。为此探究小肠酸碱度对嗜酸乳杆菌黏附调控的关系,实验用磷酸盐缓冲液配制不同pH的培养基以维持菌体营养供给和实验所需酸碱环境,建立体外模型评价不同pH条件下的菌体黏附能力,测定srt基因及Srt相关蛋白基因表达情况。探究不同pH环境下的菌体黏附能力、黏附能力与分选酶相关蛋白基因表达之间的关系。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

LactobacillusacidophilusATCC4356、HT-29细胞 均为本实验室保存;srt基因、mub基因、msa基因、lspA基因及gapdh基因引物 英潍捷基(上海)贸易有限公司;黏液蛋白Ⅱ型 美国SIGMA公司;细菌总RNA提取试剂盒 美国OMEGA公司;DNA Mark、Trans DNA Mark II、细菌基因组DNA试剂盒、反转录PCR试剂盒、qRT-PCR试剂盒 北京全式金生物技术有限公司;南美胎牛血清 上海依科赛生物制品有限公司。

Multigene Thermal Cycler型PCR仪 Labnet公司;Centerifuge 5415R型台式高速冷冻离心机 Eppendorf公司;Universal HoodⅡ型凝胶成像分析系统 Bio-Rad公司;M200 PRO型TECAN酶标仪 瑞士TECAN公司;Mini Drop ExCell Bio公司;IX53型荧光倒置显微镜 日本OLYMPUS公司;LightCycler® 96型荧光定量PCR 瑞士Roche公司。

1.2 实验方法

1.2.1 不同pH条件下嗜酸乳杆菌的生长曲线和pH曲线测定 将嗜酸乳杆菌菌种活化后,以2%的接种量接种到使用0.1 mol/L磷酸盐缓冲液配制的pH5.5、6.0、6.5、7.0、7.5的200 mL MRS培养基中。37 ℃连续静置培养,每隔3 h使用平板菌落计数法对各实验组菌液进行计数并测定培养基的pH,记录实验数据。分析实验数据后绘制各实验组的嗜酸乳杆菌生长曲线和pH变化曲线。

1.2.2 蛋白黏附性实验 用PBS(50 mmol/L,pH7.2)将猪II型黏蛋白稀释至浓度为2 mg/mL。100 μL/孔的蛋白液量加入Costar 96孔透明板中,37 ℃孵育1 h后,用PBS洗三次以除去未与板孔结合的蛋白。移除孔中上层液后,将96孔板在55 ℃烘箱中烘干20 min。在各pH条件下培养的嗜酸乳杆菌在37 ℃恒温培养10 h,离心PBS洗涤三次,调整菌液密度至1.0(OD600)。100 μL/孔加入菌悬液,恒温培养箱中37 ℃孵育3 h,使得菌体沉降至黏蛋白表面,板孔中未黏附的菌体用50 mmol/L PBS(0.05% Tween 20,pH7.2)洗涤3次。用1 mg/mL的结晶紫溶液对黏附菌体染色100 μL/孔,室温下孵育45 min,过量的结晶紫用PBS洗涤三次,100 μL/孔,后在板孔中加入100 μL/孔的PBS于恒温培养箱中37 ℃摇动孵育1 h,酶标仪中595 nm处测定所得溶液的吸光值,吸光值与黏附细菌数量成正比,统计分析实验数据[24]。

1.2.3 细胞黏附性实验 HT-29细胞培养皿加入含有双抗(青霉素和链霉素1×)的细胞全培,置于5%的CO2培养箱中37 ℃常规贴壁培养,待细胞长满培养皿底面积的80%后传代培养,实验过程中均用指数生长期细胞。

各实验组嗜酸乳杆菌培养10 h,离心(5000 r/min,15 min)PBS洗涤菌体两次,并将菌液密度调至1.0(OD600)。取10 mL菌液,离心(5000 r/min,15 min)加入10 mL无双抗细胞培养基,震荡混匀后于细胞六孔培养皿中每孔加入1 mL菌液,置于细胞培养箱中37 ℃混合培养2 h,移除上层菌液后PBS清洗三次。置于显微镜下观察各组嗜酸乳杆菌的黏附情况,统计各实验组平均每两个细胞所黏附的菌数[25]。

1.2.4 嗜酸乳杆菌在不同pH条件下srt基因及分选酶相关蛋白基因表达差异 NCBI中获得目的基因和内参基因的基因序列,使用primer 5.0软件进行相应分选酶及分选酶相关蛋白基因和内参基因gapdh基因的引物设计,引物设计结果如表1所示:

嗜酸乳杆菌总RNA的提取及cDNA合成,使用OMEGA公司提供的细菌总RNA提取试剂盒(Bacterial RNA kit),按照试剂盒说明书提取各实验组培养10 h的菌体总RNA。

表1 qRT-PCR基因引物设计Table 1 Primer design for qRT-PCR

然后根据核酸电泳RNA纯度鉴定结果及各组测得总RNA浓度,按照Transgen cDNA合成试剂盒操作说明合成cDNA。实验采用20 μL反应体系,体系各组份组成如下:Total RNA 1000 ng;5×TransScript® All-in-One SuperMix for qPCR 4 μL;gDNA Remover 1 μL;RNase-free Water To 20 μL。将各组样品轻轻混匀,点甩离心后放入普通PCR仪中,实验参数设置:42 ℃孵育15 min,85 ℃加热5 s失活TransScript® RT/RI和gDNA Remover,冷却阶段4 ℃恒温放置。cDNA样品,4 ℃保存备用。

实验用qRT-PCR LightCycler® 96仪器,采用20 μL反应体系,体系各组份组成如下:Template(cDNA)1 μL;Forward Primer(10 μmol/L)0.4 μL;Reverse Primer(10 μmol/L)0.4 μL;2×TransStart® Top/Tip Green qPCR SuperMix 10 μL;ddH2O 8.2 μL;Toal volume 20 μL;实验用Roche专用96孔板加样后封膜,点甩后进行qRT-PCR扩增。实验参数设置:94 ℃预变性30 s,循环一次;94 ℃变性5 s,60 ℃退火30 s,循环45次;在60 ℃退火30 s时采集荧光值。之后增加熔解曲线分析步骤:95 ℃变性10 s,65 ℃退火60 s,97 ℃变性1 s,循环一次;在97 ℃变性1 s时连续采集荧光值。冷却阶段:37 ℃孵育600 s,不进行荧光信号采集。

1.3 数据统计与分析

每个实验均重复三次,实验数据使用SAS V8版本统计软件分析,方差分析采用Duncan's Multiple Range Test分析比较,用origin 8.5软件作图。

2 结果与分析

2.1 不同pH条件下嗜酸乳杆菌的生长曲线和培养基pH变化曲线测定结果

各实验组嗜酸乳杆菌生长曲线及对应培养基pH变化曲线测定分析结果如图2所示:

图2 嗜酸乳杆菌不同条件下的生长曲线及pH变化曲线Fig.2 The growth and pH variation curves for Lactobacillus acidophilus in different MRS medium

由图2可知,pH过低和过高培养条件下嗜酸乳杆菌调整期较长,静置培养5 h左右进入对数生长期,细菌大量增殖,25～30 h各组活菌数达到最大,最大菌数有差异。连续监测培养10 h各组菌处于对数生长期,菌液pH与初始pH偏差均小于0.25,pH处于稳定可控范围。

培养基pH在10 h内稳定可控主要由于缓冲溶液能中和菌体代谢产生的H+,后期嗜酸乳杆菌大量繁殖,产生大量乳酸、乙酸超出了缓冲溶液缓冲能力,导致培养基环境pH急剧下降。嗜酸乳杆菌能够在低pH条件下生长繁殖,主要原因是低pH下细胞膜对H+转运能力提高和产碱酶活力提高,降低了环境对菌体产生危害[22]。

2.2 黏附实验结果与分析

2.2.1 蛋白黏附实验结果 体外模型下的蛋白黏附实验结果如图3所示:

图3 黏蛋白对各处理组嗜酸乳杆菌的黏附情况Fig.3 Adhesion conditions of Lactobacillus acidophilus under differnt treatment groups on the mucin注：标注不同字母表示差异极显著(p<0.01), 标注相同字母表示差异不显著(p>0.05),图5同。

表2 各实验组嗜酸乳杆菌对HT-29细胞的黏附情况Table 2 Adhesion conditions to HT-29 cell of different groups

注:黏附细胞数采用平均值±标准误;a、b、c表示差异性显著(p<0.01)。由图3可知pH5.5～6.5各实验组与对照组之间黏附于黏蛋白的菌体数量无显著差异(p>0.05),由于嗜酸乳杆菌具有较强耐酸性,而在弱酸性低梯度范围内培养条件对菌体生长影响较小,所以差异并不显著。在pH7.0～7.5培养条件下,菌体黏附于黏蛋白的数量相对于其他组显著增加(p<0.01),菌体对黏蛋白黏附随着pH的增加逐渐增强。

2.2.2 细胞黏附性实验结果 各实验组嗜酸乳杆菌对HT-29细胞的黏附情况,统计分析实验结果如表2所示:

图4 各基因的熔解曲线Fig.4 The dissociation curve of each gene注:a、b、c、d、e分别是srt、mub、msa、lsp、gapdh基因的熔解曲线。

由表2可知各组对比结果表明pH7.5时菌体的黏附数量最多,pH6.5～7.5与其他各实验组相比细菌黏附数量显著增加(p<0.01),嗜酸乳杆菌对HT-29细胞的黏附性增强。

菌体黏附到黏蛋白是与宿主细胞相互作用引起特定反应的第一步[26]。蛋白黏附实验和细胞黏附实验测定在pH4.5～7.5黏附能力增强,菌体更多的黏附于肠道蛋白上则有利于菌体进一步于小肠道细胞相互作用。实验结果与王彦,孟祥晨等人研究pH对双歧杆菌的黏附能力研究结果具有一致性,但引起黏附能力改变的因素除表面凝聚力和疏水性方面外还有待进一步的证实[27]。由于菌体在肠道黏附定植需要菌体表面黏附蛋白的参与,据此探究了菌体表面相关黏附蛋白基因表达量的变化。

2.3srt基因与相关蛋白基因相对表达差异结果

LightCycler 96分析软件,编辑样品孔后导出各基因熔解曲线(如图4所示)及扩增的Cq值。采用2-ΔΔCt法,以gapdh基因为内参基因,计算各实验组相对于pH5.5组的各基因相对表达量,分析各组实验数据,结果如图5所示:

图5 不同pH培养条件下各基因相对表达量Fig.5 The relativity quality of each gene in different pH

由图5可以看出:在从pH5.5～7.5变化过程中,srt基因、mub基因、msa基因及lspA基因相对表达量均上调。在pH7.5时相对于pH4.5条件下srt基因、mub基因、msa基因、lspA基因表达量分别显著上调了17.1倍、5.9倍、2.6倍、2.5倍(p<0.01)。

Emma K. Call等人研究将乳酸杆菌中分选酶基因敲除后菌体黏附性降低[20]。由于分选酶负责分选酶相关蛋白的加工锚定,因此分选酶基因表达量及分选酶相关蛋白基因表达量的变化可影响菌体黏附性。嗜酸乳杆菌细胞壁分选酶及相关黏附蛋白基因表达量增加,实验结果与菌体黏附性变化趋势一致。

3 结论

嗜酸乳杆菌的黏附性研究对了解乳酸菌益生作用机制具有重要意义。嗜酸乳杆菌在pH5.5～7.5的培养条件下,菌体对黏蛋白和HT-29细胞的黏附性增强。原因可能是分选酶基因表达上调后,分选酶合成量增加,能够催化锚定较多SDPs蛋白到嗜酸乳杆菌细胞壁表面。由于嗜酸乳杆菌在机体肠道内黏附功能的发挥需要SDPs的参与,所以在正常小肠弱碱性环境中菌体更易黏附定植于人体小肠上皮细胞表面,延长嗜酸乳杆菌在小肠内的驻留时间,促进益生功能发挥。实验为pH对分选酶及分选酶相关基因表达和嗜酸乳杆菌黏附性影响提供相关理论依据,对于pH对嗜酸乳杆菌黏附效应影响除分选酶相关黏附蛋白因素外,还可以通过基因组学及蛋白组学技术进一步探究pH对菌体黏附差异影响的机制。

[1]张国华,何国庆. 传统发酵食品中乳酸菌多样性及其功能特性[J]. 中国食品学报,2013,13(9):174-181.

[2]陈功,张其圣,余文华,等. 四川泡菜乳酸菌多样性及其功能特性[J]. 食品与发酵工业,2013,39(3):1-4.

[3]Bron P A,Peter V B,Michiel K. Emerging molecular insights into the interaction between probiotics and the host intestinal mucosa[J]. Nature Reviews Microbiology,2011,10(1):66-78.

[5]Mobili P,Gerbino E,Tymczyszyn E E,et al. S-layers in lactobacilli:structural characteristics and putative role in surface and probiotic properties of whole bacteria[J]. Current research,technology and education topics in applied microbiology and microbial biotechnology. Formatex Research Center,Badajoz,2010:1224-1234.

[6]von Ossowski I,Satokari R,Reunanen J,et al. Functional characterization of a mucus-specific LPXTG surface adhesin from probioticLactobacillusrhamnosusGG[J]. Applied & Environmental Microbiology,2011,77(13):4465-4472.

[7]Sengupta R,Altermann E,Anderson R C,et al. The role of cell surface architecture of lactobacilli in host-microbe interactions in the gastrointestinal tract[J]. Mediators of Inflammation,2013,2013(1):74-75.

[8]Hynönen U,Palva A. Lactobacillus surface layer proteins:structure,function and applications[J]. Applied Microbiology & Biotechnology,2013,97(12):5225-5243.

[9]Lebeer S,Vanderleyden J,De Keersmaecker SC. Host interactions of probiotic bacterial surface molecules:comparison with commensals and pathogens[J]. Nature Reviews Microbiology,2010,8(3):171-184.

[10]Hanne J,Stefan R,Hans J,et al. Role ofLactobacillusreutericell and mucus-binding protein A(CmbA)in adhesion to intestinal epithelial cells and mucusinvitro[J]. Microbiology,2014,160(4):671-681.

[11]章文明. 仔猪源高粘附性乳酸杆菌的分离鉴定、肠道定植及其粘附相关表面蛋白功能分析[D]. 杭州：浙江大学,2014.

[12]Marraffini L A,Dedent A C,Schneewind O. Sortases and the Art of Anchoring Proteins to the Envelopes of Gram-Positive Bacteria[J]. Microbiology & Molecular Biology Reviews,2006,70(1):192-221.

[13]Mazmanian S K,Liu G,Ton-That H,et al.Staphylococcusaureussortase,an enzyme that anchors surface proteins to the cell wall[J]. Science,1999,285(5428):760-763.

[14]Zhang J,Wu W,Liu S. Antiinfective therapy with a small molecule inhibitor ofStaphylococcusaureussortase[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2014,111(4):13517-13522.

[15]谭祥龙,许玲,石景,等. 转肽酶Sortase A在蛋白质修饰中的应用[J]. 化学进展,2014(10):1741-1751.

[16]Ilangovan U,Ton-That H,Iwahara J,et al. Structure of sortase,the transpeptidase that anchors proteins to the cell wall ofStaphylococcusaureus[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences,2001,98(11):6056-6061.

[17]Zong Y,Bice T T H,Schneewind O,et al. Crystal structures ofstaphylococcusaureussortase A and its substrate complex[J]. Acta Cryst D,2004,60(30):31383-31389.

[18]Ton-That H,Marraffini L A,Schneewind O. Protein sorting to the cell wall envelope of Gram-positive bacteria[J]. Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-Molecular Cell Research,2004,1694(1):269-278.

[19]Kaushik J K,Kumar A,Duary R K,et al. Functional and probiotic attributes of an indigenous isolate of Lactobacillus plantarum.[J]. Plos One,2009,4(12):e8099.

[20]Call E K,Goh Y J,Selle K,et al. Sortase-deficient lactobacilli:effect on immunomodulation and gut retention.[J]. Microbiology,2015,161(2):311-21.

[21]Mazmanian S K,Liu G,Jensen E R,et al.Staphylococcusaureussortase mutants defective in the display of surface proteins and in the pathogenesis of animal infections[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences,2000,97(10):5510-5515.

[22]袁峥. 嗜酸乳杆菌耐酸机理研究[D]. 新乡：河南科技学院,2013.

[23]王静颖. 人体内的酸碱度[J]. 生物学通报,2004,39(7):62-62.

[24]de Wouters T,Jans C,Niederberger T,et al. Adhesion Potential of Intestinal Microbes Predicted by Physico-Chemical Characterization Methods[J]. PloS one,2015,10(8):e0136437.

[25]Uroic K,Novak J,Hynnoen U,et al. The role of S-layer in adhesive and immunomodulating properties of probiotic starter cultureLactobacillusbrevisD6 isolated from artisanal smoked fresh cheese[J]. LWT-Food Science and Technology,2016,69:623-632.

[26]Van Tassell M L,Miller M J. Lactobacillus adhesion to mucus.[J]. Nutrients,2011,3(5):613-36.

[27]王彦,孟祥晨,王丽群,等. 低pH处理对两歧双歧杆菌KLDS2.0603黏附能力的影响[J]. 微生物学通报,2012,39(6):797-803.

Influence of pH on expression of sortase related genes and adhesion ability ofLactobacillusacidophilus

WANG Gang1,WU Zhen1,PENG Liu-yang1,PAN Dao-dong1,2,*,WANG Wen-wen1,ZENG Xiao-qun1

(1.Key Laboratory of Animal Protein Food Deep Processing Technology of Zhejiang Province,Ningbo University,Ningbo 315211,China;2.Food Science & Nutrition Department of Nanjing Normal University,Nanjing 210097,China)

TostudytheadhesionmechanismofLactobacillus acidophilusinthegutandtherelationshipofbetweenadhesionmechanismwithsortaseandsortasedependentproteinsgenes. In vitro,theadherencewasevaluated.Meanwhile,thesrtgeneandrelatedgenesexpressionweredeterminateunderdifferentpH.TheresultsshowedthatthegeneexpressionlevelsofsrtandrelatedproteinsincreasedsignificantlywiththerangeofpHfrom5.5to7.5.Also,theadhesivenessofLactobacillus acidophiluswasalsoenhanced.ItrevealedsomemechanismsofadhesionabilityinLactobacillus acidophilusupondifferentpHvalues.

Lactobacillus acidophilus;pH;adhesion;enzymeactivity;differentialexpression

2016-06-06

王刚(1989-)，男，硕士研究生，研究方向：乳品微生物，E-mail:mcgangwang@163.com。

*通讯作者:潘道东(1964-)，男，博士，教授，研究方向：乳品科学，E-mail:daodongpan@163.com。

国家自然科学基金面上项目(31471598；41276121)；浙江省自然科学基金青年基金项目(LQ16C200002)；江苏省自然科学基金项目(BK20141447)；国家科技部/星火计划(2015GA701043)；浙江省动物蛋白食品精深加工技术重点实验室开放基金 (ZX2015000928)；学校人才工程项目(理)/人才引进(ZX2015000594)。

TS252.1

A

1002-0306(2016)21-0166-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.21.024