柳叶腊梅叶总黄酮超声波协同复合酶提取及抗氧化活性研究

耿敬章

(陕西理工大学生物科学与工程学院,陕西汉中 723000)



柳叶腊梅叶总黄酮超声波协同复合酶提取及抗氧化活性研究

耿敬章

(陕西理工大学生物科学与工程学院,陕西汉中 723000)

以柳叶腊梅叶为原料,研究复合酶协同超声波提取柳叶腊梅叶总黄酮的提取工艺及体外抗氧化活性。以柳叶腊梅叶总黄酮的提取量为指标,确定了最佳处理酶为纤维素酶和果胶酶复合添加,添加比例为3∶1。并通过响应面优化实验确定柳叶腊梅叶总黄酮提取最佳工艺条件为超声功率290 W,超声提取时间24 min,乙醇浓度90%,液料比27(mL/g)。在此条件下进行验证实验,柳叶腊梅叶总黄酮的提取量达到83.1 mg/g。抗氧化实验表明柳叶腊梅叶总黄酮的自由基清除效果为IC50(DPPH·)=1.22 mg/mL,IC50(·OH)=0.92 mg/mL,因此,柳叶腊梅叶总黄酮具有较好的体外抗氧化活性。

柳叶腊梅叶,总黄酮,提取,复合酶,抗氧化

柳叶蜡梅(ChimonanthussalicifoliusS.Y.H)为蜡梅科蜡梅属植物[1],俗称石凉茶、山蜡茶等,是优良的香料植物和药用植物,为畲族广泛应用的中草药之一[2-3],并且国家卫生计生委已经批准柳叶蜡梅作为新食品原料开发利用[4]。现代药理研究表明,山腊梅茶对抗菌消炎、抗病毒效果显著[5]。研究表明,柳叶蜡梅富含挥发油、槲皮素、黄酮类、生物碱等有效活性成份,具有清热解毒、预防感冒、助消化、止泻、减肥、消脂降压、预防心脑血管疾病的作用[6-8]。其中黄酮类化合物是柳叶腊梅叶中最主要的功能性成分[9]。黄酮类化合物是一类具有抗氧化、抗肿瘤、降血糖以及增强免疫力等功效的生物活性的物质总称,目前,黄酮类化合物提取方法以乙醇浸提法和超声波、微波辅助提取法[10-11]为主,而复合酶协同超声提取柳叶腊梅叶总黄酮仍未见报道。因此,本实验选取柳叶腊梅叶为原料,优化复合酶协同超声提取柳叶腊梅叶总黄酮的工艺条件,并研究其体外抗氧化活性,以期为柳叶腊梅的开发利用提供参考。

1 材料及方法

1.1 材料与仪器

柳叶腊梅叶 采集于陕南植物园,洗净后60 ℃烘干,粉碎。过60～80目筛,备用;芦丁标准品 中国药品生物制品检定所,纯度99.7%;纤维素酶(酶活力10000 U/g)、果胶酶(酶活力 30000～100000 U/g)、中性蛋白酶(酶活力10000 U/g)、木瓜蛋白酶(酶活力10000 U/g)、碱性蛋白酶(酶活力10000 U/g) 和氏璧生物技术有限公司;VC、乙醇、NaOH、NaNO2、Al(NO3)3等,所有试剂均为分析纯,天津市富宇精细化工有限公司;HPD-600型大孔树脂 郑州勤实科技有限公司。

ZN-02型粉粹机 北京兴时利和科技有限公司;TU-1221紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器公司;QCD6150型数控超声清洗器 天津恒瑞机电设备有限公司;TDL-40B型离心机 上海安亭科学仪器厂;Al204型电子天平 梅特勒-托利多仪器 上海有限公司;DHF-9055A型电热鼓风干燥箱 上海一恒科技有限公司;RE5298型旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂 等。

1.2 实验方法

1.2.1 柳叶腊梅叶总黄酮提取工艺流程 柳叶腊梅叶→称取→调pH→酶解→灭酶→超声辅助提取→真空抽滤→收集滤液→滤渣再提取→合并滤液→减压浓缩→石油醚脱脂→旋转蒸发→柳叶腊梅叶总黄酮粗提物→大孔树脂柱→吸附→洗脱→收集→浓缩→加乙醇→旋转蒸发浓缩→真空干燥→柳叶腊梅叶总黄酮纯品

1.2.2 柳叶腊梅叶总黄酮的测定 采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法[12]。

标准溶液的配制:准确称取芦丁标准品10.0 mg置于10 mL容量瓶中,95%乙醇溶解后稀释到100 mL。分别取芦丁标准溶液0.8、1.6、2.2、3.5、5.0、10.0 mL于6只100 mL容量瓶中,加入2.0 mL 5% NaNO2溶液,放置3 min,加2.0 mL 10% Al(NO3)3溶液,放置3 min,最后加10.0 mL 4% NaOH溶液。蒸馏水定容,摇匀。以不加显色剂的空白组作对比,510 nm处测定系列标准溶液的吸光度,并绘制标准曲线。

样品的测定:准确移取一定量的样品溶液于容量瓶中,加入显色剂,定容,摇匀。以不加显色剂的空白组作对比,510 nm处测样品吸光度,代入标准曲线方程得到不同处理的总黄酮的含量,并按下式计算柳叶腊梅叶总黄酮的提取量。

其中,M为柳叶腊梅叶总黄酮的提取量(mg/g);M1为不同处理所得的总黄酮的含量(mg);M0为不同处理所用柳叶蜡梅原料质量(g)。

1.2.3 酶种类的选择 参考有关文献[13],分别选取纤维素酶、果胶酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶,添加量为柳叶蜡梅质量的2%,于42 ℃的恒温水浴锅中酶解90min,然后煮沸灭酶10min,在乙醇浓度为80%、超声功率为300W、液料比为15(g/mL)的条件下提取20min。以柳叶腊梅叶总黄酮提取量为指标,筛选出适合柳叶腊梅叶总黄酮提取的酶种类。

1.2.4 复合酶添加比例的确定 纤维素酶和果胶酶分别按4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4(g/g)比例添加,添加柳叶蜡梅质量2%,其他同1.2.3操作。

1.2.5 柳叶腊梅叶总黄酮提取条件的优化 通过单因素实验考察乙醇浓度、超声功率、超声提取时间、液料比对柳叶腊梅叶总黄酮提取效果的影响,在选取各因素的最优实验范围,采用响应面优化法对柳叶腊梅叶总黄酮超声提取条件进行优化。

1.2.5.1 超声功率对柳叶腊梅叶总黄酮提取效果的影响 设定超声提取时间20min,乙醇浓度为85%,液料比为21(g/mL),分别在超声功率为150、200、250、300、350、400、450W七个梯度下提取柳叶腊梅叶总黄酮并且测其提取量。

1.2.5.2 超声提取时间对柳叶腊梅叶总黄酮提取效果的影响 设定超声功率300W,乙醇浓度为85%,液料比为21(g/mL),分别在超声提取时间为5、10、15、20、25、30、35min七个梯度下提取柳叶腊梅叶总黄酮并且测其提取量。

1.2.5.3 乙醇浓度对柳叶腊梅叶总黄酮提取效果的影响 设定超声功率为300W,超声提取时间为20min,液料比为21(g/mL),分别在乙醇浓度为70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%七个梯度下提取柳叶腊梅叶总黄酮并且测其提取量。

1.2.5.4 液料比对柳叶腊梅叶总黄酮提取效果的影响 设定超声功率为300W,超声提取时间为20min,乙醇浓度为85%,分别在液料比为12、15、18、21、24、27、30(mL/g)七个梯度下提取柳叶腊梅叶总黄酮并且测其提取量。

1.2.5.5 响应面优化实验 结合单因素实验结果,选取超声功率、超声提取时间、乙醇浓度、液料比,以总黄酮提取量为评价指标,采用响应面实验设计方案,优化柳叶腊梅叶总黄酮超声波协同复合酶提取的工艺条件,因素水平见表1。

1.2.6 柳叶腊梅叶总黄酮抗氧化活性研究

1.2.6.1DPPH·清除率的测定 参考ShimadaK等[14]的方法。取柳叶腊梅叶黄酮溶液1.0mL与10mL100μmol/L的DPPH·溶液加入同一试管中,摇匀,黑暗中放置20min,测其吸光度,下列公式计算清除率:

清除率(%)=[(Ac-Ai)/Ac]×100

式中:Ac-去离子水加DPPH·溶液的吸光度;Ai-柳叶腊梅叶黄酮溶液加DPPH·溶液的吸光度。

1.2.6.2 羟自由基(·OH)清除能力的测定 采用邻二氮菲-Fe2+氧化法测定[15]。

表1 实验因素水平及编码Table 1 Test factors level and coding

2 结果与分析

2.1 标准曲线绘制

按1.2.2方法得到的510 nm处标准曲线方程式经统计回归处理,得到线性方程为y=7.3673X-0.0179,R2=0.9998,x为标准品的浓度(mg/mL);y为吸光度。

2.2 酶种类对柳叶腊梅叶总黄酮提取效果的影响

由图1可知,当选用单一酶时,柳叶腊梅叶总黄酮提取量较低,只选用纤维素酶时,总黄酮提取量为单一酶组最高为54.2 mg/g。然而,两者酶复合使用时,总黄酮提取量提高,纤维素酶和果胶酶复合使用时,总黄酮提取量达到64.7 mg/g。这可能因为两种酶彼此之间存在协同作用,提高了提取量。故提取柳叶腊梅叶总黄酮时,选择纤维素酶和果胶酶复合使用。

图1 酶种类对柳叶腊梅叶总黄酮提取量的影响Fig.1 Influence of types of enzyme on extraction rate of total flavonoids

2.3 酶添加比例对柳叶腊梅叶总黄酮提取效果的影响

由图2可知,纤维素酶和果胶酶以3∶1(g/g)比例比添加时总黄酮提取量较高,故选择纤维素酶和果胶酶的添加比例为3∶1(g/g)。

图2 纤维素酶和果胶酶添加比例 对柳叶腊梅叶总黄酮提取量的影响Fig.2 Influence of addition ratio of cellulose and pectinase on extraction of total flavonoids

2.4 柳叶腊梅叶总黄酮提取条件的优化

2.4.1 超声功率对柳叶腊梅叶总黄酮提取效果的影响 超声波的空化作用能在液体内部产生强烈的冲击波和微射流,有助于细胞内组分渗透到溶液中,由图3可以看出,在150～300 W范围内,柳叶腊梅叶总黄酮提取量随着超声功率的增加而随之增大,当超声功率为300 W时提取量达到最大,因此最佳超声功率应该控制在300 W左右。

图3 超声功率对提取效果的影响Fig.3 Influence of ultrasonic frequency on extraction effect

2.4.2 超声提取时间对柳叶腊梅叶总黄酮提取效果的影响 由图4可以看出,在5～20 min范围内,柳叶腊梅叶总黄酮提取量随着超声时间的延长而随之增大,当超声时间为20 min时提取量达到最大,继续增加超声处理时间,其黄酮提取量反而降低,分析造成此结果的可能原因是:长时间高温超声处理会破坏黄酮类化合物的结构,影响黄酮的得率。因此最佳提取时间应该控制在20 min左右。

2.4.3 乙醇浓度对柳叶腊梅叶总黄酮提取效果的影响 由图5可以看出,在乙醇浓度70%～85%范围内,随着乙醇浓度的增大,柳叶腊梅叶总黄酮提取量逐渐增加,85%时达到最大,随后随着乙醇浓度的增大,柳叶腊梅叶总黄酮提取量逐渐降低。这是因不同体积分数的乙醇水溶液极性不同,黄酮类化合物具有较高的极性,85%乙醇水溶液极性与黄酮类化合物的极性相似,故选取乙醇浓度85%为宜。

图5 乙醇浓度对提取效果影响Fig.5 Influence of ethanol concentration on extraction effect

2.4.4 液料比对柳叶腊梅叶总黄酮提取效果的影响 如图6所示,在液料比12～24(g/mL)范围内,柳叶腊梅叶总黄酮提取量随着料液比的增大而增加,当料液比达到24(mL/g)时,柳叶腊梅叶总黄酮提取量达到最大,之后随着料液比增大,柳叶腊梅叶总黄酮提取量增加趋于平衡,同时,增大料液会增加溶剂的消耗以及影响提取液的浓缩过程,为节约试剂考虑,因此选择液料比24(mL/g)为宜。

图6 液料比对提取效果的影响Fig.6 Influence of solution to material ratio on extraction effect

2.4.5 柳叶腊梅叶总黄酮提取条件的优化实验 结果见表2。

表2 柳叶腊梅叶总黄酮提取实验设计及结果Table 2 Test design and results of total flavonoids from Chmonathus salicifolius S.Y.H leaves

关于柳叶腊梅叶总黄酮的提取量二次回归拟合方程:

提取量(mg/g)=77.47+6.48A+10.38B+6.95C+0.42D+4.52AB+2.52AC+9.33A D-0.65BC+7.91BD+4.55CD-7.78A2-8.22B2-6.85C2-2.44D2(其中,A为超声功率,B为超声提取时间,C为乙醇浓度,D为液料比)。

由表3可以看出,模型的p值为<0.0001,而失拟项的p值为0.3078,说明了柳叶腊梅叶总黄酮提取的模型与实际情况拟合程度比较好,可以预测柳叶腊梅叶总黄酮提取的条件。对柳叶腊梅叶总黄酮提取进行分析,超声功率、超声提取时间、乙醇浓度、液料比都是显著因素。

由方差分析结果可以看出,AB的交互作用、AC的交互作用、AD的交互作用、BC的交互作用、BD的交互作用、CD的交互作用都显著,相应曲面图见图7至图12。

图7 超声波功率与超声波提取时间交互作用 对提取量影响的响应面Fig.7 Response surface of influence of extraction power and extraction time interaction on extraction amount

表3 回归方程各项的方差分析Table 3 The variance analysis of regression equation

图8 超声波功率与乙醇浓度作用 对提取量影响的响应面Fig.8 Response surface of influence of extraction power and ethanol concentration interaction on extraction amount

图9 超声波功率与液料比交互作用 对提取量影响的响应面Fig.9 Response surface of influence of extraction power and solution to material ratio interaction on extraction amount

图10 超声波提取时间与乙醇浓度交互作用 对提取量影响的响应面Fig.10 Response surface of influence of extraction time and ethanol concentration interaction on extraction amount

图11 超声波提取时间与液料比交互作用 对提取量影响的响应面Fig.11 Response surface of influence of solution to material ratio material ratio interaction on extraction amount

图12 乙醇浓度与液料比交互作用 对提取量影响的响应面Fig.12 Response surface of influence of extraction time and ethanol concentration and solution to interaction on extraction amount

注:“Prob>F”<0.05,代表研究因素为显著因素。根据柳叶腊梅叶总黄酮提取实验结果和回归方程各项的方差分析,由响应面分析法优化出柳叶腊梅叶总黄酮提取最佳工艺条件为超声功率287.8 W,超声提取时间24.4 min,乙醇浓度89.7%,液料比26.6(g/mL)。并考虑到实际操作的便利性,确定超声功率290 W,超声提取时间24 min,乙醇浓度90%,液料比27(g/mL)。在此条件下进行验证实验,三次平行实验取平均值,柳叶腊梅叶总黄酮的提取量达到83.1 mg/g。

2.5 柳叶腊梅叶总黄酮体外抗氧化研究

2.5.1 柳叶腊梅叶总黄酮对DPPH·的清除能力的测定 DPPH·法操作简单,反应灵敏,目前已广泛应用于多种天然产物或单一化合物的抗氧化能力评价[16]。由图13可知,在实验浓度范围内,随着柳叶腊梅叶总黄酮添加量的增加,DPPH·的清除率升高。在浓度小于1.4 mg/mL时,柳叶腊梅叶总黄酮对DPPH·的清除率明显小于对照组VC,然而当浓度大于1.4 mg/mL时,柳叶腊梅叶总黄酮对DPPH·的清除率与相同浓度的VC溶液清除能力逐渐接近。因此,柳叶腊梅叶总黄酮(IC50=1.22 mg/mL)具有较好的清除DPPH·的能力。

图13 柳叶腊梅叶总黄酮对DPPH·的清除能力Fig.13 Scavenging activity of total flavonoids from Chmonathus salicifolius S.Y.H leaves to DPPH·

图14 柳叶腊梅叶总黄酮对羟自由基(·OH)清除能力Fig.14 Scavenging activity of total flavonoids from Chmonathus salicifolius S.Y.H leaves to ·OH

2.5.2 柳叶腊梅叶总黄酮对羟自由基(·OH)清除能力的测定 ·OH是目前已知的最活泼的自由基,也是毒性最大的自由基[17]。由图14可以看出,随着浓度增大,柳叶腊梅叶总黄酮对·OH的清除能力逐渐增强。当浓度小于1.2 mg/mL时,柳叶腊梅叶总黄酮清除·OH的能力小于对照组VC,当柳叶腊梅叶总黄酮浓度在1～1.4 mg/mL时,柳叶腊梅叶总黄酮清除·OH的能力显著提高,之后清除·OH的能力总是大于VC。当柳叶腊梅叶总黄酮浓度为2.6 mg/mL,对·OH的最大清除率可达91.3%。这说明柳叶腊梅叶总黄酮(IC50=0.92 mg/mL)具有较强的清除·OH的能力。

3 结论

提取柳叶腊梅叶总黄酮最佳酶种类为纤维素酶和果胶酶复合添加,且按酶比例3∶1添加。提取柳叶腊梅叶总黄酮最佳工艺条件为超声功率290 W,超声提取时间24 min,乙醇浓度90%,液料比27(g/mL)。在此条件下进行验证实验,三次平行实验取平均值,柳叶腊梅叶总黄酮的提取量达到83.1 mg/g。在柳叶腊梅叶黄酮提取过程中,各因素的交互作用对实验结果有较大的影响。当操作条件发生改变时,应根据因素间的交互作用适当调节其他因素,以保证有较好的提取效果。

考察了柳叶腊梅叶总黄酮的抗氧化活性,比较了柳叶腊梅叶总黄酮对DPPH·和·OH自由基的清除效果。结果表明,柳叶腊梅叶总黄酮具有良好的清除自由基能力,柳叶腊梅叶总黄酮的清除效果为IC50(DPPH·)=1.22 mg/mL,IC50(·OH)=0.92 mg/mL,因此,柳叶腊梅叶总黄酮具有较好的体外抗氧化活性,说明柳叶腊梅叶总黄酮的抗氧化能力不仅受黄酮的浓度的影响,而且还与自由基的种类有关。

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Extraction of total flavonoids fromChmonathussalicifoliusS.Y.H leaves by complex enzymatic hydrolysis assisted iltrasonic and its antioxidant activity

GENG Jing-zhang

(College of Biological Science and Engineering,Shaanxi SCI-TECH Universiiy,Hanzhong 723000,China)

TheextractionoftotalflavonoidsfromChmonathus salicifoliusS.Y.Hleavesbycomplexenzymatichydrolysisassistedultrasonicanditsantioxidantactivitywerestudied,theoptimumenzymeontheextractionamountoftotalflavonoidsfromChmonathus salicifoliusS.Y.Hleaveswerecelluloseandpectinase,andtheratioofcelluloseandpectinasewas3∶1.TheoptimumextractionconditionsoftotalflavonoidsfromChmonathus salicifoliusS.Y.Hleavesweredeterminedbyresponsesurfacemethodology.Itwasconcludedthatultrasonicextractionpowerfor290W,ultrasonicextractiontimefor24min,ethanolconcentrationfor90%,andthesolutionandmaterialratiofor27(mL/g).AndtheextractionamountoftotalflavonoidsfromChmonathus salicifoliusS.Y.Hleavesreached83.1mg/g.TheflavonoidsfromChmonathus salicifoliusS.Y.Hleaveshadgoodantioxidantactivityin vitro,theoxidationexperimentsshowedthattheIC50ofDPPH·and·OHwere1.22mg/mLand0.92mg/mL,sotheflavonoidsfromChmonathus salicifoliusS.Y.Hhadgoodantioxidantactivity.

Chmonathus salicifoliusS.Y.Hleaves;totalflavonoids;extraction;compositeenzymatic;antioxidantactivity

2016-04-25

耿敬章(1980-)，男，硕士，副教授，研究方向：食品质量控制与资源开发利用研究，E-mail:gengjingzhang@163.com。

陕西省社会发展攻关项目(2016SF-354)。

TS202

A

1002-0306(2016)21-0124-07

10.13386/j.issn1002-0306.2016.21.016