响应面法优化亚麻籽氢氰酸提取条件

寇向龙,徐美蓉,张建平,赵宾宾,韩舜愈,*

(1.甘肃农业大学食品科学与工程学院,甘肃兰州 730070;2.甘肃省农业科学院,甘肃兰州 730070)



响应面法优化亚麻籽氢氰酸提取条件

寇向龙1,2,徐美蓉2,张建平2,赵宾宾1,韩舜愈1,*

(1.甘肃农业大学食品科学与工程学院,甘肃兰州 730070;2.甘肃省农业科学院,甘肃兰州 730070)

为了提高亚麻籽中的氢氰酸含量检测的效率,同时确保其准确性,用响应面法对异烟酸-巴比妥酸比色法前处理中的提取方法进行了优化。运用Design Expert 7.0数据分析软件在单因素实验的基础上采用3因素3水平的响应面分析法,建立了氢氰酸提取率与各影响因子的回归方程。结果表明:氢氰酸的最佳提取条件为液固比50∶1(mL/g)、提取时间45 min、氢氧化钠吸收液浓度 10 g/L,氢氰酸实际提取率可达96.12%。结论:此方法真实可靠,可用于大批量检测亚麻籽中的氢氰酸含量。

亚麻籽,氢氰酸,生氰糖苷,异烟酸-巴比妥酸比色法,响应面法

亚麻籽是世界十大油料之一[1],因富含α-亚麻酸和亚油酸[2]及木酚素[3]而具有增强机体免疫力[4]、提高记忆力、降血脂血糖[5]、延缓衰老[6]和抗癌[7]等保健功效。然而,亚麻籽中的生氰糖苷可在β-葡萄糖苷酶的作用下生成剧毒的氢氰酸[8],是影响其开发利用的阻碍[9],使亚麻籽的开发程度与所含功能成分很不对称[10]。因此,亚麻籽中氢氰酸的检测对其品种改良具有重要意义。

氢氰酸的检测方法主要有硝酸银滴定法、吡啶-巴比妥酸光度法、异烟酸-吡唑啉酮分光光度法、异烟酸-巴比妥酸比色法等[8]。

周小洁等对上述4种氢氰酸检测方法进行了比对实验,认为所得结果没有显著的差异,均可用于亚麻籽的检测[8]。但各方法均有局限性。硝酸银滴定法检测灵敏度低,稳定性差[11];吡啶有刺激性气味和较大毒性,对实验人员的身体健康有较大影响,一般实验室不适用[12]。异烟酸-吡唑啉酮显色时间较长,需40 min[13]。综合比较异烟酸-巴比妥酸比色法相对其他方法更有优势[8,12],其原理是在中性条件下,氰化物与氯胺T作用生成氯化氰,再与异烟酸反应,生成戊烯二醛,最后与巴比妥酸作用产生一种紫蓝色的化合物,在一定浓度范围内,其色度与氰化物含量成正比。于600 nm波长处测其吸光度,与标准曲线比较,即可得所测样品氰化物的含量[14]。

本实验选用异烟酸-巴比妥酸比色法来检测亚麻籽中的氢氰酸含量,并参考国标GB/T 15665-1995《豆类 配糖氢氰酸含量的测定》[15]中的水解法,利用响应面分析法对异烟酸-巴比妥酸比色法的前处理的提取过程加以优化,使其更加精确可靠。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

亚麻籽,陇亚10号 由甘肃农业科学院作物研究所亚麻课题组提供。

Cary 50紫外可见光分光光度计 美国瓦里安公司;BS124S 电子天平 德国Sartorius公司;KjeltecTM 8200半自动凯氏定氮仪 丹麦FOSS公司;SPH-2102C恒温摇床 上海世平实验设备有限公司;GH-2000A低噪音空气泵 北京中兴公司。

1.2 实验方法

1.2.1 氢氰酸提取 提取方法参考孟凡信等的方法[16],将亚麻籽样品用粉碎机粉碎后,称取2.00 g置于250 mL具塞锥形瓶中,加蒸馏水后,盖上盖子放在摇床上振荡提取。经抽滤后,吸取滤液10 mL于凯氏定氮仪样品管中,加入100 g/L乙酸锌溶液20 mL,再加入酒石酸1～2 g,立即用半自动凯氏定氮仪进行蒸馏,用装有10 mL氢氧化钠溶液的100 mL容量瓶收集馏出液,注意管子一定要通到液面以下,当馏出液接近100 mL时,取下容量瓶,加蒸馏水至刻度。

1.2.2 样品检测及标准曲线的绘制 向8个25 mL具塞比色管各加入氢氰酸标准使用液(10 μg/mL)0、0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL,加少量水稀释,同时取样品馏出液5 mL,加入25 mL具塞比色管中。分别向各管滴入1.0 g/L酚酞指示剂1滴,然后用3%的乙酸溶液调至红色刚好消失,用水定容至10 mL刻度,加入136 g/L磷酸二氢钾缓冲液3 mL和10 g/L氯胺T溶液 0.25 mL,混匀后,放置2 min。然后在各管加入5 mL异烟酸-巴比妥酸溶液。25 ℃下显色15 min,上机检测,检测前先用空白管调零。根据结果绘制标准曲线。根据标准曲线和样品所测吸光值可得出样品中的氢氰酸含量[16]。

计算公式:P(mg/kg)=(A×V1×10×1000)/(m×V2×1000)

P-样品中氰氰酸的含量(mg/kg)；A-从曲线中查出的氢氰酸质量(μg);m-样品质量(g);V1-试样馏出液的体积(mL)；V2-加入比色管的流出液的体积(mL)；10-稀释倍数。

提取率Y(%)=P/P0×100[17]

P0-国标GB/T 15665-1995《豆类 配糖氢氰酸含量的测定》[15]中方法所测得氢氰酸含量(114.08 mg/kg,五次重复)。

1.2.3 前处理条件优化 选取液固比、提取时间、吸收液浓度作为影响因素,以氢氰酸的提取率为评价指标,进行单因素实验。

1.2.3.1 固液比的影响 称取2.00 g 亚麻籽,氢氧化钠吸收液浓度12 g/L,提取时间40 min,分别加水60、80、100、120 mL(既液固比为 30∶1、40∶1、50∶1、60∶1)。

1.2.3.2 提取时间的影响 称取2.00 g 亚麻籽,氢氧化钠吸收液浓度12 g/L,加水100 mL,设置提取时间为20、30、40、50、60 min。

1.2.3.3 氢氧化钠吸收液浓度 称取亚麻籽2.00 g,加水100 mL,提取时间40 min。选用不同浓度的氢氧化钠吸收液4、12、20、40 g/L做提取率比对实验。

在单因素实验的基础上,利用 Design-Expert 7.0 软件进行数据分析,研究各个因素之间对亚麻籽氢氰酸提取率的影响,作出响应面图,对亚麻籽氢氰酸检测前处理条件进行优化。表1为响应面的实验设计表。

表1 提取工艺因素水平表Table 1 Levels of each factor

2 结果与分析

2.1 标准曲线

所得标准曲线如图1,曲线方程为y=0.0832x-0.0078,其中y为吸光值,x为标样比色管中所含的氢氰酸质量(μg)。相关系数R2=0.9998,说明方程具有良好的线性相关。

图1 氢氰酸质量标准曲线图Fig.1 The standard curve of hydrocyanic acid quality

2.2 单因素实验结果

2.2.1 液固比对氢氰酸提取率的影响 如图2所示,50∶1的提取率最高,60∶1有所下降可能是由于稀释浓度太低,抽滤和上机时损失较多。因此最佳液固比最终确定为50∶1。

图2 不同固液比下的氢氰酸提取率Fig.2 Hydrocyanic acid extraction rate of different solid-liquid ratio

2.2.2 提取时间对氢氰酸提取率的影响 如图3所示,提取率随提取时间的增长而有所增加,到40 min后变化不明显,因此最终选用40 min。

图3 不同提取时间下的氢氰酸提取率Fig.3 Hydrocyanic acid extraction rate in different extraction time

2.2.3 氢氧化钠吸收液浓度对氢氰酸提取率的影响 如图4所示,当氢氧化钠浓度为12 g/L时,提取率最高,浓度增大后提取率下降是由于氢氧化钠浓度过高导致馏出液碱性过强,无法用乙酸将pH调至中性,在碱性环境下,显色剂无法发生显色反应。最终选择了12 g/L的氢氧化钠作为氢氰酸吸收液。

图4 不同浓度氢氧化钠对提取率的影响Fig.4 Effect of different concentrations of sodium hydroxide on the extraction rate

2.3 响应面分析结果

在单因素实验基础上,根据Box-Behnken实验设计原理,采用3因素3水平15个实验点(3个中心位点)的响应面分析法对氢氰酸提取条件进行优化,实验数据见表2。

表2 响应面实验方案及结果Table 2 Scheme and experimental results of response surface design

表3 模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

各因素交互作用的响应面图见图5。从图5可以直观地看出各因素交互作用对响应值亚麻籽氢氰酸提取率的影响。当液固比和提取时间固定时,提取率随氢氧化钠吸收液浓度变化幅度较大。提取率随液固比以及提取时间变化幅度相对较小。所以氢氧化钠吸收液浓度对亚麻籽氢氰酸的提取率影响显著[18]。

图5 各两因素的响应面图Fig.5 Response surface showing the pairwise interactive effects of three factors on extraction rate

经响应面回归分析得到的最佳前处理条件为液固比50.39∶1(mL/g)、提取时间44.94 min、吸收液氢氧化钠的浓度10.19 g/L,在此条件下亚麻籽氢氰酸提取率理论值为 96.66%。为了便于实际操作,将最佳条件修正为液固比 50∶1(mL/g)、提取时间45 min、吸收液浓度 10 g/L。在修正条件下,验证实验测得亚麻籽氢氰酸提取率为96.12%,与理论值相比较为吻合。

3 结论

利用响应面分析法确定了氢氰酸的最佳提取条件为为液固比50∶1(mL/g)、提取时间45 min、吸收液浓度10 g/L,验证实验测得亚麻籽氢氰酸提取率为96.12%,与理论预测值96.66%较为吻合。说明此方法真实可靠,可用于大批量检测亚麻籽中的氢氰酸含量。

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Optimization of extraction conditions for hydrocyanic acid in flaxseed by response surface methodology

KOU Xiang-long1,2,XU Mei-rong2,ZHANG Jian-ping2,ZHAO Bin-bin1,HAN Shun-yu1,*

(1.College of Food Science and Engineering,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China;2.Gansu Academy of Agricultural Sciences,Lanzhou 730070,China)

Inordertoimprovetheefficiencyofdetectionforhydrocyanicacidcontentinflaxseed,whileensuringitsaccuracy,Thepretreatmentmethodofisonicotinic-barbituricacidcolorimetricmethodhadbeenoptimizedbyresponsesurfacemethodology.Aquadraticpolynomialregressionmodelwasfittedusingathree-factor,three-levelBox-Behnkendesignandanalyzedusingresponsesurfacemethodologytoobtaintheoptimalextractionconditions.Theresultshowedthatthebestextractiontechnologyconditionswasattheratioofsolventandmaterial50∶1,with10g/Lconcentrationofsodiumhydroxideabsorbingliquidandextractingfor45min.Thehydrocyanicacidextractionratiocouldreach96.12%.Thismethodistrueandreliable,canbeusedtodetectlargequantitiesofhydrocyanicacidinflaxseed.

flaxseed;hydrocyanicacid;cyanogenicglycosides;isonicotinic-barbituricacidcolorimetry;responsesurfacemethodology

2016-05-10

寇向龙(1988-)，男，硕士研究生，助理研究员，研究方向：营养与食品卫生学，E-mail：kxlong0125@126.com。

*通讯作者:韩舜愈(1963-)，男，博士，教授，研究方向：果蔬加工及葡萄酒风味化学，E-mail：gsndhsy@163.com。

TS207.3

B

1002-0306(2016)21-0201-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.21.030