云南白牛肝菌酶解工艺优化

刘 佳,王桂瑛,程志斌,谷大海,范江平,王雪峰,葛长荣,廖国周,*

(1.云南农业大学食品科学技术学院,云南昆明 650201;2.云南农业大学云南省畜产品加工工程技术研究中心,云南昆明 650201)



云南白牛肝菌酶解工艺优化

刘 佳1,2,王桂瑛1,2,程志斌2,谷大海1,2,范江平1,2,王雪峰1,2,葛长荣2,廖国周1,2,*

(1.云南农业大学食品科学技术学院,云南昆明 650201;2.云南农业大学云南省畜产品加工工程技术研究中心,云南昆明 650201)

为白牛肝菌高值化利用与开发提供科学依据。以云南白牛肝菌边角料为原材,以水解度和感官评分为指标,在单因素实验基础上采用正交实验优化制备鲜味物质的酶解工艺条件。结果表明:风味蛋白酶复合木瓜蛋白酶的最佳酶解条件是酶添加量均为0.3%,料水比为1∶7(g/mL),初始pH为6.0,酶解温度为50 ℃,酶解时间为4 h。采用最佳酶解条件酶解白牛肝菌边角料,所得酶解液蛋白质水解度为20.16%,感官评分为30.56分。云南白牛肝菌边角料在风味蛋白酶和木瓜蛋白酶最适条件下酶解效果最佳,所得酶解液香气浓郁,风味独特,可用来生产高质量风味调料,同时提高副产品利用率。

白牛肝菌,边角料,水解度,感官评价

云南独特地理气候条件造就野生食用菌品种多样、产量高、分布广、闻名海内外。牛肝菌属资源丰富,风味独特,营养价值高,是我国珍稀食材之一,常见黑牛肝菌(铜色牛肝菌)、黄牛肝菌(黄皮疣柄牛肝菌、黄癞头)、白牛肝菌(美味牛肝菌)、小美牛肝菌(见手青)[1]。其中,白牛肝菌最著名,分布在云南、四川、福建等地,桂明英[2]等对白牛肝菌氨基酸含量测定,氨基酸种类齐全,含量丰富。呈味氨基酸、核苷酸与挥发性的酮、醇、酚、酯等化合物一起构成白牛肝菌独特鲜香风味,极具开发潜力[3]。

然而,多年来云南省受精深加工技术水平限制,野生食用菌产品形式单一,主要以鲜品、干品、速冻、盐渍品为市场主要销售产品,缺乏精深加工制品,导致出口创汇能力低,产品附加值低,同时每年在收购、加工过程中有大量菇柄、残次品和碎屑被废弃,按10%的废弃率计算,每年将废弃3000多吨,不但增加环境污染,而且大量原料资源无法消化[4-5]。如何对这部分资源进行高值化利用是目前创新研究焦点[6]。国内外已经对多个品种的食用菌子实体有研究,但对白牛肝菌加工边角料开发风味调料的研究报道极少[7]。充分利用白牛肝菌边角料开发新产品是可持续发展的绿色环境友好型举动,不仅产品附加值、出口创汇能力能得到提高,白牛肝菌的应用领域能得到扩宽,而且能减少资源浪费与造成的环境污染。本研究以白牛肝菌边角料为原料,筛选高效复合酶,研究复合酶对白牛肝菌蛋白的最佳酶解条件,为后期生产风味独特、绿色营养的高品质调味料提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

白牛肝菌边角料 云南玉溪市易门康源菌业有限公司,真空包装后置于-20 ℃冰箱备用,使用前解冻;木瓜蛋白酶(80万U/g)、菠萝蛋白酶(50万U/g)、中性蛋白酶(10万U/g)、碱性蛋白酶(10万U/g)、风味蛋白酶(10万U/g) 均购自江苏锐阳生物科技有限公司;其他试剂 国产分析纯。

MJ-BL25c4组织捣碎机 广东美的精品电器制造有限公司;101型电热鼓风干燥箱 北京中兴伟业仪器有限公司;JJ-1精密增力搅拌器 常州澳华仪器有限公司;DK-98-Ⅱ电热恒温水浴锅 天津市泰斯特仪器有限公司;TGL-16C高速台式离心机 上海安亭科学仪器厂;KDN-04B半自动凯氏定氮仪 浙江托普仪器有限公司;日立L8800全自动氨基酸分析仪 天美科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 主要营养成分测定方法

1.2.1.1 水分测定 按 GB5009.3 测定[8]。

1.2.1.2 粗蛋白测定 按GB5009.5 测定[9]。

1.2.1.3 氨基酸测定 按GB/T 5009.124-2003测定[10]。所有样品分析为5个重复,结果以平均值计。

1.2.2 白牛肝菌酶解工艺

1.2.2.1 酶解工艺 称取一定质量的白牛肝菌边角料,洗净,按一定料水比打浆,倒入适当容器内放入电热恒温水浴锅中,在一定温度下先恒温水浴15 min,调至一定初始pH,加入一定种类,一定量的蛋白酶水解,匀速搅拌,酶解一定时间后沸水浴灭酶10 min,灭酶后待料液降至常温25 ℃,5000 r/min离心10 min,取上清液。

1.2.2.2 甲醛滴定法测定氨基态氮 参考文献[11],运用公式DH(%)=(游离氨基态氮/总氮)×100[8]求得水解度(degree of hydrolysis,DH),水解度越高,反映蛋白酶解效果越好,释放出游离氨基酸越多。

1.2.2.3 感官评价(sensory evaluation,SE) 请10名(5男5女)专训过的感官评价员对酶解液从色泽、气味、滋味、体态四方面感官评定,与白牛肝菌原料风味的接近程度进行比较评分,每项10分,共40分,接近程度最大的10分,接近程度较大的8分,接近程度一般的6分,接近程度较小的4分,接近程度最小的2分,完全不接近的0分,四项总分为综合感官评分,以接近程度最大的酶解液为佳[12]。

对酶解上清液水解度测定和感官评价均为5个重复,结果以平均值计。同时做空白实验。

1.2.3 单一酶筛选 根据木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、风味蛋白酶特性和大量预实验结果确定酶解基本条件,见表1,选择相对于白牛肝菌边角料底物(以白牛肝菌边角料干重计,下文同)的六个加酶量水平,即0%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%。考察不同酶、不同添加量对酶解效果的影响,评价指标为水解度和感官评分。

表1 单一酶酶解工艺设计Table 1 The process design on enzymatic hydrolysis of a single enzyme

注:P1-木瓜蛋白水解酶;P2-菠萝蛋白酶;N-中性蛋白酶;A-碱性蛋白酶;F-风味蛋白酶,表2同，图6～图8同。

1.2.4 双酶筛选 根据1.2.3所得结果,将风味蛋白酶分别复合木瓜蛋白酶,菠萝蛋白酶和中性蛋白酶进行双酶筛选实验,在单酶筛选基础上确定复合酶解基本条件为见表2,固定风味蛋酶添加量为0.3%,选择另一种酶的五个加酶量水平,即0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%,考察各双酶组合及不同添加量对酶解效果的影响,评价指标为水解度和感官评分。

表2 双酶酶解工艺设计Table 2 The process design on enzymatic hydrolysis of two enzymes

1.2.5 复合酶单因素实验 根据1.2.4所得结果,固定风味蛋白酶和木瓜蛋白酶的添加量均为0.3%,考察料水比、酶解温度、酶解时间和初始pH对复合酶酶解效果影响,评价指标为水解度和感官评分。

1.2.5.1 料水比的选择实验 固定温度50 ℃,初始pH6.5,酶解时间4 h,研究不同料水比(1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10 (g/mL)对酶解效果影响。

1.2.5.2 酶解温度的选择实验 根据1.2.5.1所得结果,固定料水比1∶7(g/mL),初始pH6.5,酶解时间4 h,研究不同温度(35、40、45、50、55、60、65 ℃)对酶解效果影响。

1.2.5.3 酶解时间的选择实验 根据1.2.5.1、1.2.5.2所得结果,固定料水比1∶7(g/mL),温度45 ℃,初始pH为6.5,研究时间(1、2、3、4、5、6 h)对酶解效果影响。

1.2.5.4 酶解初始pH的选择实验 根据1.2.5.1、1.2.5.2、1.2.5.3所得结果,固定料水比1∶7(g/mL),温度45 ℃,酶解时间4 h,研究不同初始pH(4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)对酶解效果影响。

1.2.6 正交设计实验 以1.2.5复合酶单因素实验中影响最显著因素进行正交实验,研究酶解效果达最佳的酶解条件。用L9(34)正交实验设计因素水平,见表3。

表3 正交实验因素水平表Table 3 The factors and levels of orthogonal test

1.2.7 数据处理 所有数据均以“平均数±标准差”表示。实验数据处理由Excel完成,作图由Origin75完成,正交实验设计由正交设计助手完成,方差分析由spss19.0完成。

2 结果与讨论

2.1 白牛肝菌边角料主要营养成分

白牛肝菌边角料水分含量为88.73%,粗蛋白含量为35.4%,全氨基酸含量为20.78%。水分是直接影响食用菌鲜嫩的因素之一,何培新[1]测得食用牛肝菌含水量86.8%,桂明英[2]测得美味牛肝菌鲜品含水量86.4%～87.9%,与本实验白牛肝菌边角料含水分相差不大,说明白牛肝菌水分含量充足,鲜嫩可口。李燕平[13]测得巴山白牛肝菌粗蛋白含量31.81%,比本实验中白牛肝菌边角料粗蛋白含量低3.79%。段玉云[14]测得牛肝菌全氨基酸含量24.60%,比本实验中白牛肝菌边角料全氨基酸含量高3.82%。说明白牛肝菌蛋白含量高,氨基酸含量丰富。

2.2 蛋白酶种类选择

2.2.1 木瓜蛋白酶较适添加量的确定 由图1知,木瓜蛋白酶添加量从0.1%～0.3%时,水解度、感官评分均不断增大,在0.3%、0.4%、0.5%时水解度相差甚微,在0.4%时水解度达最大,在0.3%时感官评分达最大,说明当酶量为0.3%时,底物几乎酶解完全。当酶添加量从0.3%增加到0.5%,水解度不再增加且略有下降,此结果与程玉[12]对海鲜菇酶解条件研究中酶添加量对水解度的影响类似,原因是底物或酶解产物对酶活有抑制。综上及结合经济效益分析,确定其较适添加量为0.3%,此时水解度17.97%,感官评分27.04分。

图1 木瓜蛋白酶添加量对水解度和感官评分的影响Fig.1 Effect of addition content of Papaya protease on DH and SE

2.2.2 菠萝蛋白酶较适添加量的确定 由图2知,随菠萝蛋白酶添加量从0.1%～0.3%时,水解度、感官评分均不断增加,在0.4%时,水解度达最大,在0.3%、0.4%、0.5%时感官评分相差甚微,其中在0.5%时感官评分达最高;在0.4%、0.5%时,水解度与感官评分相差不大,综上分析,确定其较适添加量为0.4%,此时水解度17.32%,感官评分22.96分。

图2 菠萝蛋白酶添加量对水解度和感官评分的影响Fig.2 Effect of addition content of Pineapple protease on DH and SE

2.2.3 中性蛋白酶较适添加量的确定 由图3知,随中性蛋白酶添加量增加,水解度、感官评分均不断增大,但水解度增大趋势不明显,当酶加量为0.3%时,水解度达到最大值,感官评分也达到最大值,在0.4%和0.5%时,水解度与酶加量为0.3%时相差不大。综上及结合经济效益分析,确定其较适添加量为0.3%,此时水解度14.10%,感官评分25.44分。

图3 中性蛋白酶添加量对水解度和感官评分的影响Fig.3 Effect of addition content of Neutral protease on DH and SE

2.2.4 碱性蛋白酶较适添加量的确定 由图4知,水解度随碱性蛋白酶添加量增加而减小,当酶加量为0.1%时水解度最大,在0.2%时水解度大幅减小,在0.2%～0.5%时水解度减小趋势平缓。随酶量增加感官评分却降低,不加酶时,感官评分最高,表明碱性蛋白酶作用于底物后在感官方面难以接受。综上分析,确定其较适添加量为0.1%,此时水解度13.06%,感官评分19.04分。

图4 碱性蛋白酶添加量对水解度和感官评分的影响Fig.4 Effect of addition content of Alkali protease on DH and SE

2.2.5 风味蛋白酶较适添加量的确定 由图5可知,随风味蛋白酶添加量的增加,水解度、感官评分也增加。当酶加量为0.3%时,水解度达到最大值,此时感官评分也较好;当酶加量为0.4%、0.5%时,水解度与酶加量为0.3%时相差不大,感官评价较0.3%时稍高。综上分析,确定较适添加量为0.3%,此时水解度14.75%,感官评分23.28分。

图5 风味蛋白酶添加量对水解度和感官评分的影响Fig.5 Effect of addition content of Flavourzyme on DH and SE

2.2.6 五种单一酶对酶解实验效果的影响比较 综合2.2.1～2.2.5的结果分析可知,各单一酶在较适酶解条件下对水解度和感官评分的影响,见图6,木瓜蛋白酶水解度和感官评分均最高,分别为17.92%,27.04分。碱性蛋白酶水解度和感官评分均最低,分别为13.06%,19.04分。根据蛋白酶特性和大量预实验结果可知,风味蛋白酶能让白牛肝菌边角料酶解液具有独特食用菌鲜香,降低蛋白酶解液苦味。复合酶水解既能提高蛋白水解度,减轻苦味,提高速率。双酶复合分为同加和单酶分步加,但双酶同加有操作简便,速率更快等优点[12,15],所以双酶复合原则:一是与风味酶复合。二是复合后水解度达到最大的两种酶,高水解度不仅可以降低水解液苦味,同时释放更多呈味游离氨基酸。本实验中除风味蛋白酶外,其他四种酶均使酶解液有较高水解度,但考虑碱性蛋白酶调节初始pH操作繁琐,所得酶解液风味较差,故弃选碱性蛋白酶,而用风味蛋白酶与其他三种分别进行组合完成后续实验。

图6 单一酶较适条件下对水解度和感官评分的影响Fig.6 Effect of a single enzyme on DH and SE under nearly favourrable conditions

2.2.7 最佳复合酶的确定 由图7知,随酶加量增加,风味蛋白酶与木瓜蛋白酶组合的水解度不断增加,水解度最高达18.17%,且总高于风味蛋白酶与菠萝蛋白酶、中性蛋白酶组合;由图8知,随酶加量增加,风味蛋白酶与木瓜蛋白酶组合的感官评分不断增加,感官评分最高达27.12分,且总高于风味酶与菠萝蛋白酶,中性蛋白酶组合。因此选择风味蛋白酶与木瓜蛋白酶组合酶解白牛肝菌边角料制备酶解液,为后续增香热反应奠定基础。

图7 双酶添加量对水解度的影响Fig.7 Effect of addition content of two enzymes on hydrolytic rate of protein efficiency

图8 风味蛋白酶添加量对感官评分的影响 Fig.8 Effect of addition content of two enzymes on sensory evaluation efficiency

2.3 复合酶单因素实验

2.3.1 不同料水比对白牛肝菌边角料酶解效果的影响 由图9知,料水比从1∶4至1∶7时,水解度增加,何培新[7]对美味牛肝菌下脚料抽提物最佳提取工艺里说明,底物浓度降低,底物与起催化反应的蛋白酶充分接触,更多的酶切位点被催化使蛋白质水解为多肽,进而水解为游离氨基酸;超过1∶7后随着溶液体积的增加,底物浓度继续降低使底物与酶接触机会减少,水解度呈下降趋势。料水比对色泽、气味、滋味、体态均有明显影响,料水比在1∶7 (g/mL)时水解度及感官评分达最大,此时水解度19.94%,感官评分28.72分,故较适料水比为1∶7 (g/mL)。

图9 不同料水比对水解度和感官评分的影响Fig.9 Effect of ratios of water on DH and SE efficiency

2.3.2 不同酶解温度对酶解效果的影响 由图10知:当温度由35 ℃升到45 ℃时,水解度,感官评分逐渐增大,水解度在45 ℃时达到最大;当温度由45 ℃升高到65 ℃时,水解度逐渐降低,感官评分先保持稳定后逐渐降低。李霞[17]在对香菇风味物质酶解提取工艺中提到,温度影响酶活性,当适宜温度时升温可以让酶促反应速率加快,但温度过高可导致酶失活,酶反应逐渐降低致水解度出现下降。综上分析,确定较适温度为45 ℃。

图10 酶解温度对水解度和感官评分的影响Fig.10 Effect of hydrolysis temperature on DH and SE efficiency

2.3.3 不同酶解时间对酶解效果的影响 由图11知:当酶解时间由1 h增至4 h时,水解度,感官评分明显增大;当酶解时间由4 h增加到6 h时,水解度逐渐趋于平缓,感官评分降低,李霞[17]在对香菇风味物质酶解提取工艺中提到,随时间增长底物被酶解完全,而过度的酶解可能使酶解液呈现苦味。综上分析确定较适酶解时间为4 h。

图11 酶解时间对水解度和感官评分的影响Fig.11 Effect of hydrolysis time on DH and SE efficiency

2.3.4 不同初始pH对酶解效果的影响 由图12可知:当初始pH从4.5～6.0时,水解度、感官评分均上升,6.0～7.0时感官评分相差不大;当初始pH继续增至7.0时,水解度,感官评分均有下降。程玉[12]对海鲜菇酶解条件研究中指出,pH影响底物和酶的稳定性,进而影响二者结合,过酸过碱的条件都不利于酶正常发挥活性。综上分析,确定较适初始pH为6.0。

图12 初始pH对水解度和感官评分的影响Fig.12 Effect of initial pH on DH and SE efficiency

2.3.5 正交实验结果及数据分析 据表4正交实验结果计算极差R(r),通过R(r)大小对酶解效果的影响因素进行主次排队,比较表4中A,B,C,D四个因素中可以看出影响水解效果主次顺序为:B(酶解温度)>D(初始pH)>A(料水比)>C(酶解时间);影响感官评分主次顺序为:D(初始pH)>A(料水比)>B(酶解温度)>C(酶解时间)。以水解度为评价指标所得到最优方案为A2B3C2D2,以感官评分为评价指标所得到的最优方案为A2B3C2D2,综上,得到最优酶解条件:酶解料水比1∶7 (g/mL),酶解温度50 ℃,酶解时间4 h,初始pH为6.0。

表4 L9(34)正交实验结果Table 4 Results of L9(34)orthogonal experimental

2.3.6 验证实验 取10 g新鲜白牛肝菌边角料,按照最佳酶解条件和工艺进行酶解得最佳酶解液,经测定,水解度为20.16%±0.33%,感官综合评分为(30.56±0.61)分。通过验证实验测出的水解度和感官评分比正交实验中最优方案稍高,说明本实验得到的最优酶解条件较为可靠。

3 结论

云南白牛肝菌边角料在风味蛋白酶和木瓜蛋白酶最适条件下酶解效果最佳,所得酶解液香气浓郁,风味独特,可用来生产高质量风味调料,同时提高副产品利用率。白牛肝菌水分含量为88.73%,粗蛋白含量为35.4%,氨基酸含量为20.78%。风味蛋白酶复合木瓜蛋白酶的最佳酶解条件是酶添加量均为0.3%,料水比为1∶7(g/mL),初始pH为6.0,酶解温度为50 ℃,酶解时间为4 h。采用最佳酶解条件酶解白牛肝菌边角料,所得酶解液蛋白质水解度为20.16%,感官评分为30.56分。

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Process optimization of enzymatic hydrolysis ofBoletusEdulisin Yunnan

LIU Jia1,2,WANG Gui-ying1,2,CHENG Zhi-bin2,GU Da-hai1,2,FAN Jiang-ping1,2,WANG Xue-feng1,2,GE Chang-rong2,LIAO Guo-zhou1,2,*

(1.College of food science and technology,Yunnan Agricultural University,Kunming 650201,China;2.Yunnan Animal Products Processing Engineering and Technology Research Center,Yunnan Agricultural University,Kunming 650201,China)

Thestudycanprovideascientificbasistothehigh-valueuseanddevelopmentforBoletus Edulis.ThebyproductsofBoletus edulisinYunnanwereusedasmaterial,thedegreeofhydrolysisandsensoryevaluationwereanalyzed.InordertostudytheprocessoptimizationofenzymatichydrolysisforpreparationofumamiextractsfromthebyproductsofBoletus EdulisinYunnan.Thestudywasbasedoninvestigationsofsingle-factor,theprocessoptimizationofenzymatichydrolysiswasstudiedbyorthogonaldesign.Theresultssuggestedthattheprocessoptimizationofflavourzymeandpapayaproteaseenzymatichydrolysiswastheadditioncontentsofflavourzymeandpapayaprotease0.3%,theratioofwater1∶7(g/mL),initialpH6.0,hydrolysistemperature50 ℃andhydrolysistime4h.UndertheprocessoptimizationofenzymatichydrolysisforthebyproductsofBoletus Edulis,thedegreeofhydrolysiswas20.16%andthesensoryevaluationwas30.56points.Thehydrolysatewasrichofaromasanduniqueflavor.Itwasusedtoproducthighqualityflavorseasoning,itcanimproveutilizationofbyproductsatthesametime.

Boletus Edulis;byproduct;degreeofhydrolysis;sensoryevaluation

2016-05-30

刘佳(1990-)，女，硕士研究生，研究方向：食品科学，E-mail：lhc712@126.com。

*通讯作者:廖国周(1978-)，男，博士，副教授，研究方向：食品加工与质量控制，E-mail：LiaoGuoZhou@ynau.edu.cn。

云南省科技计划项目重大科技专项(2016ZA008);云南省科技计划项目省院省校科技合作专项(2013IB010)。

TS209

B

1002-0306(2016)21-0222-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.21.034