水解度对牡蛎酶解液特性的影响

杨 昭,姚玉静,黄佳佳,梁志理,陈丽珊,陈晓贤

(广东食品药品职业学院食品学院,广东广州 510520)

牡蛎是世界上第一大养殖贝类,也是我国四大养殖贝类之一,它肉嫩味鲜,营养丰富,被称为“海洋牛奶”[1]。牡蛎酶解产物具有抑制血管紧张素转换酶(angiotensin-I converting enzyme,ACE)、免疫增强、抗疲劳、抗氧化等多种生理活性,在功能性食品开发领域具有较大的应用前景[2-5]。

生物活性肽多以非活性状态存在于蛋白质的长链中,当用适宜的蛋白酶水解时,其活性分子片段被释放出来[6]。同种蛋白酶水解相同的蛋白质,水解度对酶解产物组成、呈味特性、功能特性和生理活性起着主要影响。中华鲟蛋白质水解物中粗蛋白含量、氨基酸总量、溶解性和抗氧化活性随着水解度的增大而升高[7]。鲢鱼酶解产物的ABTS+·清除率、脂质过氧化抑制率及还原能力均随水解度增大而升高[8]。香港牡蛎的水溶性蛋白、盐溶性蛋白和不溶性蛋白经碱性蛋白酶水解后,随着水解度的增大,溶解性逐渐增强,而蛋白的乳化性和乳化稳定性先升高后下降[9]。国内外关于牡蛎蛋白酶解研究主要集中在酶解工艺优化和生理活性研究方面[10-11]。水解度对牡蛎酶解产物感官评分、肽分子量分布和游离氨基酸组成等特性的研究较少。鉴于水解度对酶解产物的组成具有重要的影响,而酶解产物的组成是呈味特性、功能特性和生理活性的物质基础。因此,探究不同水解度牡蛎酶解液的感官评分、肽分子量分布和氨基酸组成对于其在食品工业中的应用具有重要意义。

本研究以牡蛎为原料,采用胰蛋白酶限制性水解牡蛎肉,制得不同水解度的酶解液,考察水解度对牡蛎酶解液感官评分、肽分子量分布和游离氨基酸组成及评价的影响,为牡蛎蛋白质资源的工业化利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

近江牡蛎肉(冻藏) 购于广州黄沙水产市场;胰蛋白酶(4 000 U/g) 重庆市全新祥盛生物制药有限公司;卵清蛋白、细胞色素C、维生素B12、抑肽酶、氨基酸混合标准品 美国Sigma-Aldrich公司;蔗糖、食用盐、味精 市售(食品级);其他试剂 均为分析纯。

FE22-Standard pH计 梅特勒-托利多国际贸易(上海)有限公司;DKZ-3B电热恒温振荡水槽 上海一恒科学仪器有限公司;3K15台式高速冷冻离心机 德国Sigma公司;K9840凯氏定氮仪 济南海能仪器股份有限公司;LC-20A高效液相色谱仪 日本岛津制作所;L8900全自动氨基酸分析仪 日本日立公司。

1.2 实验方法

1.2.1 不同水解度牡蛎酶解液制备 参照杨昭等[12]的方法进行调整。冻藏牡蛎肉置于室温溶解后,按照1∶1的质量比加入蒸馏水,打浆,调整溶液pH至7.0后(酶解过程中每隔30 min 调1次pH,确保pH维持在7.0),加入牡蛎肉质量0.4%的胰蛋白酶,搅拌均匀,在55 ℃下震荡酶解不同时间。酶解结束后煮沸20 min灭酶,4 ℃条件下8000 r/min离心20 min,取上清液即为牡蛎酶解液,-18 ℃冻存备用。按照上述方法,分别酶解0、0.5、2、4、8、10 h,获得水解度为0、15.98%、27.59%、35.83%、43.27%、62.02%牡蛎酶解液,分别标记为DH0、DH15.98%、DH27.59%、DH35.83%、DH43.27%、DH62.02%。

1.2.2 水解度测定 水解度测定采用甲醛滴定法[13]。

1.2.3 感官评价 参照姚玉静等[13]的方法进行感官评价。滋味标准品分别是鲜味(0.2%味精)、甜味(1%蔗糖)、咸味(0.35%食用盐)、酸味(0.04%柠檬酸)和苦味(0.02 g/L盐酸奎宁)。使用5点线性坐标,将标准品梯度稀释,最高浓度感官分值为10分,最低浓度感官分值为2分,每下降一个梯度,感官分值下降2分。样品稀释3倍,采用感官定量分析对样品进行感官评价。

1.2.4 肽分子量分布测定 肽分子量分布测定采用高效液相色谱法[6]。其中肽标准品分别为维生素B12(1355 Da)、抑肽酶(6512 Da)、细胞色素C(12384 Da)和卵清蛋白(43000 Da)。根据肽标准品出峰时间和分子量大小的对数作肽分子量标准曲线方程:y=-0.3109x+6.9925(R2=0.9932)。

1.2.5 游离氨基酸组成测定 根据GB 5009.124-2016《食品中氨基酸的测定》进行酶解液氨基酸组成测定。

1.2.6 游离氨基酸TAV分析 采用呈味强度值(taste activity value,TAV)评价游离氨基酸对酶解液滋味的贡献,即样品中各游离氨基酸的含量与该游离氨基酸阈值之比[14]。当TAV>1 时,表明该氨基酸对样品呈味有重要贡献,并且数值越大,贡献越大。而TAV<1时,表明该氨基酸对样品呈味贡献不大[15]。

1.3 数据处理

数据采用Excel 2010进行分析处理,SPSS 20.0软件进行数据差异显著性分析。数据以平均值±标准偏差表示,P<0.05为差异性显著。

2 结果与分析

2.1 水解度对牡蛎酶解液感官特性的影响

牡蛎酶解是一个复杂的蛋白质降解过程,在不同酶解时期,原料蛋白质结构、酶切位点会发生变化,导致最终酶解液的组成也有所不同,因此,不同酶解程度酶解液的感官特性也存在差异[16]。由图1可知,水解度为0的酶解液,鲜味、咸味、酸味、甜味和苦味分值均较低。这可能是因为牡蛎蛋白质未被酶解,大分子的蛋白质没有降解为呈味的小分子肽和游离氨基酸。随着水解度的增大,牡蛎酶解液的鲜味、酸味和甜味,呈现先增加后降低的趋势。其中水解度在0～43.27%之间,鲜味、酸味和甜味呈现增加趋势,水解度在43.27%～62.02%之间,鲜味、酸味和甜味呈现降低趋势。水解度为43.27%的牡蛎酶解液,获得最高分值的鲜味、酸味和甜味评分,并显著高于其他5组酶解液(P<0.05)。牡蛎酶解液的咸味和苦味,随着水解度的增大呈现一直增加的趋势。水解度为62.02%的牡蛎酶解液,获得最高分值的咸味和苦味评分,其苦味评分显著高于其他5组酶解液(P<0.05)。整体来看,水解度为43.27%的牡蛎酶解液具有最佳的滋味特征,强烈的鲜味和甜味,弱的不良风味。此研究结果与侯清娥[17]采用胰蛋白酶获得水解度为45.55%酶解液,具有浓郁海鲜风味、甘甜、微酸的感官描述一致。

图1 不同水解度牡蛎酶解液的感官评分Fig.1 Sensory score of oyster hydrolysates with different hydrolysis degree注:不同小写字母表示相同指标不同水解度差异显著(P<0.05),图2同。

2.2 水解度对牡蛎酶解液肽分子量分布的影响

蛋白质酶解产物肽分子量分布是其最重要的性质之一,将会影响酶解产物作为功能性食品材料的应用[18]。多项研究表明大分子蛋白质水解成小分子肽会提高溶解性[19]、降低起泡性[20],而抗氧化活性呈现先升高后降低的趋势[21]。牡蛎蛋白的乳化性和乳化稳定性随着水解度的增加也呈现先升高后下降的趋势[14]。酶解产物的呈味特性、功能特性和生理活性与其肽分子量分布密切相关,因此有必要探究水解度对牡蛎酶解液肽分子量分布的影响。

由图2可知,水解度对牡蛎酶解液肽分子量分布影响较大。随着水解度的增大,分子量>10 kDa和5～10 kDa肽比例逐渐减少,3～5 kDa肽比例先增加后减少,1～3 kDa和<1 kDa肽比例逐渐增大。分子量<5 kDa的肽可能会呈现滋味特征,而分子量>5 kDa的肽无滋味[22]。分子量为3～5 kDa 肽段的扇贝裙边酶解液能够明显贡献浓厚味,使其滋味更加丰富[19]。分子量<3 kDa的牡蛎酶解液,具有最强的ACE 抑制活性[2]。分子量<6 kDa的牡蛎酶解液具有较强的抗氧化和抗疲劳活性[4]。因此,分子量<5 kDa的肽可能具有较强的呈味特性和生理活性,值得深入研究。DH0、DH15.98%、DH27.59%、DH35.83%、DH43.27%、DH62.02%酶解液中<5 kDa肽比例分别为40.14%、46.12%、66.56%、70.52%、74.74%和76.18%。<1 kDa肽比例最高的是DH62.02%酶解液(18.68%),其次是DH43.27%酶解液(18.18%),两者之间不存在显著性差异。1～3 kDa肽比例最高的是DH62.02%酶解液(36.04%),其次是DH43.27%酶解液(35.06%),两者之间无显著性差异。水解度对3～5 kDa肽比例影响较小,DH0、DH15.98%、DH27.59%、DH35.83%、DH43.27%、DH62.02%酶解液中3～5 kDa肽比例分别为19.32%、20.26%、23.37%、22.46%、21.49%和21.47%。上述酶解感官分析过程中,水解度为43.27%的牡蛎酶解液具有强烈的鲜味和甜味,与其中含有丰富的小肽有关。

图2 不同水解度牡蛎酶解液的肽分子量分布范围Fig.2 The range of peptide molecular weight of oyster hydrolysates with different hydrolysis degree

2.3 水解度对牡蛎酶解液游离氨基酸组成的影响

游离氨基酸是蛋白质酶解液中重要的滋味和香味前体物质[2]。牡蛎酶解液中的游离氨基酸是重要的美拉德反应底物,对于美拉德反应改善牡蛎酶解液的风味、营养和抗氧化活性有较大的影响[24]。因此,探究不同水解度牡蛎酶解液游离氨基酸的组成和含量,对于酶解液的应用具有重要的意义。

由表1可知,不同水解度的牡蛎酶解液均含有16种氨基酸。从单一氨基酸检测结果上看,随着水解度的增大,6种水解度牡蛎酶解液中16种游离氨基酸含量均呈现逐渐增大的趋势。其中亮氨酸、谷氨酸、赖氨酸、苏氨酸、精氨酸、丙氨酸和异亮氨酸含量变化趋势最为明显。DH0酶解液中游离氨基酸含量最高的是丙氨酸(0.590 mg/g),其次是甘氨酸(0.480 mg/g)和精氨酸(0.449 mg/g)。丙氨酸、甘氨酸和精氨酸百分比分别是13.53%、11.01%和10.31%。DH15.98%酶解液中游离氨基酸含量最高的是精氨酸(0.941 mg/g),其次是丙氨酸(0.921 mg/g)和赖氨酸(0.779 mg/g)。精氨酸、丙氨酸和赖氨酸百分比分别是11.01%、10.78%和9.12%。DH27.59%酶解液中游离氨基酸含量最高的是精氨酸(1.299 mg/g),其次是赖氨酸(1.201 mg/g)、丙氨酸(1.200 mg/g)和亮氨酸(1.200 mg/g)；精氨酸、赖氨酸、丙氨酸和亮氨酸百分比分别是10.24%、9.46%、9.45%和9.45%。DH35.83%酶解液中游离氨基酸含量最高的是精氨酸(1.600 mg/g),其次是谷氨酸(1.599 mg/g)、亮氨酸(1.501 mg/g)、赖氨酸(1.501 mg/g)和丙氨酸(1.501 mg/g)；精氨酸、谷氨酸、亮氨酸、赖氨酸和丙氨酸百分比分别是9.61%、9.6%、9.02%、9.01%和9.01%。DH43.27%酶解液中游离氨基酸含量最高的是精氨酸(1.802 mg/g),其次是赖氨酸(1.8 mg/g)、丙氨酸(1.8 mg/g)和亮氨酸(1.8 mg/g)；精氨酸、赖氨酸、丙氨酸和亮氨酸百分比分别是9.30%、9.29%、9.29%和9.29%。DH62.02%酶解液中游离氨基酸含量最高的是谷氨酸(1.901 mg/g),其次是赖氨酸(1.801 mg/g)、丙氨酸(1.801 mg/g)、精氨酸(1.8 mg/g)和亮氨酸(1.8 mg/g)；谷氨酸、赖氨酸、丙氨酸、精氨酸和亮氨酸百分比分别是9.49%、9.49%、8.99%、8.99%和8.99%。

表1 不同水解度牡蛎酶解液的氨基酸组成Table 1 Free amino acids composition of oyster hydrolysates with different hydrolysis degree

随着水解度的增大,DH0、DH15.98%、DH27.59%、DH35.83%、DH43.27%、DH62.02%酶解液中游离氨基酸总含量呈现逐渐增加的趋势,分别为4.359、8.543、12.695、16.653、19.383和20.024 mg/g。DH15.98%、DH27.59%、DH35.83%、DH43.27%、DH62.02%酶解液中游离氨基酸总含量是DH0酶解液的2.0、2.9、3.8、4.4和4.6倍。6种酶解液的必需氨基酸含量随着水解度的增大而增加。DH62.02%酶解液的必需氨基酸含量最高(9.303 mg/g),其次为DH43.27%酶解液(9.133 mg/g)。

2.4 水解度对牡蛎酶解液游离氨基酸呈味特性的影响

酶解液中的游离氨基酸组成、含量、百分比和阈值对其滋味有较大的影响。依据各游离氨基酸的呈味特征,把氨基酸分为鲜味、甜味、苦味和无味(芳香族氨基酸)[25]。由图3可知,随着水解度的增大,鲜味氨基酸、甜味氨基酸和苦味氨基酸含量均呈现逐渐增加的趋势,芳香族氨基酸呈现先增加后降低的趋势。鲜味氨基酸含量最高的是DH62.02%酶解液(4.402 mg/g),其次为DH43.27%酶解液(4.069 mg/g)。甜味氨基酸含量最高的是DH62.02%酶解液(6.920 mg/g),其次为DH43.27%酶解液(6.581 mg/g)。苦味氨基酸含量最高的是DH62.02%酶解液(6.401 mg/g),其次为DH43.27%酶解液(6.333 mg/g)。芳香族氨基酸含量最高的是DH43.27%酶解液(2.399 mg/g),其次为DH62.02%酶解液(2.301 mg/g)。

图3 不同水解度牡蛎酶解液的呈味氨基酸含量Fig.3 The content of flavor amino acids of oyster hydrolysates with different hydrolysis degree

由图4可知,随着水解度的增大,6种酶解液中鲜味氨基酸的百分比缓慢增加,苦味氨基酸的百分比缓慢增加后逐渐减少,甜味氨基酸的百分比逐渐减少后趋于稳定。6种水解度酶解液中具有较佳滋味的鲜味氨基酸和甜味氨基酸之和均大于50%。鲜味氨基酸百分比最大的是DH62.02%酶解液(21.98%),其次为DH43.27%酶解液(20.99%)。甜味氨基酸百分比最大的是DH0酶解液(45.62%),其次为DH15.98%酶解液(37.12%)。苦味氨基酸百分比最大的是DH27.59%酶解液(33.08%),其次为DH35.83%酶解液(32.74%)。

图4 不同水解度牡蛎酶解液的呈味氨基酸百分比Fig.4 The percentage of flavor amino acids of oyster hydrolysates with different hydrolysis degree

然而,由于各氨基酸的味觉阈值不同,呈味氨基酸含量高和百分比高的酶解液并不一定具有最佳的感官评分[26]。由表2可知,随着水解度的增大,6种酶解液中TAV>DH0酶解液中TAV>1的氨基酸只有1种,是谷氨酸(1.30)。DH15.98%酶解液中TAV>1的氨基酸有4种,分别是谷氨酸(2.23)、精氨酸(1.88)、赖氨酸(1.56)和丙氨酸(1.54)。DH27.59酶解液中TAV>1的氨基酸有7种,分别是谷氨酸(3.34)、精氨酸(2.60)、赖氨酸(2.40)、丙氨酸(2.00)、缬氨酸(1.70)、蛋氨酸(1.33)和组氨酸(1.20)。DH35.83%酶解液中TAV>1的氨基酸有8种,分别是谷氨酸(5.33)、精氨酸(3.20)、赖氨酸(3.00)、丙氨酸(2.50)、缬氨酸(2.35)、蛋氨酸(1.74)、组氨酸(1.70)和苯丙氨酸(1.04)。DH43.27%酶解液中TAV>1的氨基酸有9种,分别是谷氨酸(5.66)、精氨酸(3.60)、赖氨酸(3.60)、丙氨酸(3.00)、缬氨酸(2.75)、蛋氨酸(2.10)、组氨酸(1.90)、苯丙氨酸(1.33)和异亮氨酸(1.11)。DH62.02%酶解液中TAV>1的氨基酸有9种,分别是谷氨酸(6.34)、精氨酸(3.60)、赖氨酸(3.60)、丙氨酸(3.00)、缬氨酸(2.75)、组氨酸(2.10)、蛋氨酸(2.00)、苯丙氨酸(1.33)和异亮氨酸(1.11)。6种水解度牡蛎酶解液中谷氨酸TAV值均大于1,且随着水解度的增大TAV值呈现逐渐增大的趋势,表明谷氨酸是6种水解度牡蛎酶解液游离氨基酸中最主要的呈鲜物质。刘海梅等[27]采用Protemax复合蛋白酶水解牡蛎肉,也发现酶解液中含有丰富的鲜味氨基酸,其中谷氨酸含量最高。

表2 不同水解度牡蛎酶解液游离氨基酸的TAVTable 2 Taste activity values of free amino acids of oyster hydrolysates with different hydrolysis degree

3 结论

本研究以牡蛎为原料,采用胰蛋白酶水解牡蛎肉,通过控制酶解时间制得水解度在0～62.02%之间的6种酶解液。探究水解度对牡蛎酶解液感官、肽分子量分布和游离氨基酸组成与评价的影响。结果表明,随着水解度的增大,牡蛎酶解液的鲜味、酸味和甜味评分先增加后降低,咸味和苦味一直增加。水解度为43.27%的牡蛎酶解液,获得最高分值的鲜味、酸味和甜味评分。随着水解度的增大,分子量>10 kDa和5～10 kDa肽比例逐渐减少,3～5 kDa肽比例先增加后减少,1～3 kDa和<1 kDa肽比例逐渐增加。DH0、DH15.98%、DH27.59%、DH35.83%、DH43.27%、DH62.02%酶解液中<5 kDa肽比例分别为40.14%、46.12%、66.56%、70.52%、74.74%和76.18%。<1 kDa和1～3 kDa肽比例最高的是DH62.02%酶解液。6种水解度牡蛎酶解液中各游离氨基酸含量、游离氨基酸总含量、必需氨基酸含量随着水解度的增大而呈现逐渐增大的趋势。DH15.98%、DH27.59%、DH35.83%、DH43.27%、DH62.02%酶解液中游离氨基酸总含量是DH0酶解液的2.0、2.9、3.8、4.4和4.6倍。鲜味氨基酸、甜味氨基酸和苦味氨基酸含量均随着水解度的增大而逐渐增加,芳香族氨基酸先增加后降低。随着水解度的增大,6种酶解液中TAV>1的氨基酸数量逐渐增多。6种水解度牡蛎酶解液中谷氨酸TAV值均大于1,且随着水解度的增大TAV值呈现逐渐增大的趋势,表明谷氨酸是6种水解度牡蛎酶解液中最主要的呈鲜氨基酸。牡蛎酶解液中富含丰富的小分子肽和游离氨基酸,下一步应对小分子肽进行分离鉴定,并研究美拉德反应对不同水解度牡蛎酶解液呈味特性、功能特性和生理活性的影响,为牡蛎蛋白质资源的工业化应用提供理论依据。