CHM及PHM病理组织中p57kip2、CD34、p53、CD117及EGFR的表达差异

梁尚华

CHM及PHM病理组织中p57kip2、CD34、p53、CD117及EGFR的表达差异

梁尚华

目的探讨完全性葡萄胎(CHM)和部分性葡萄胎(PHM)病理组织中p57kip2、CD34、p53、CD117及EGFR的表达差异。方法对医院妇科收治63例葡萄胎患者进行回顾性分析，其中CHM组患者33例，PHM组30例，采取免疫组织化学染色法检测病理组织中p57kip2、CD34、p53、CD117及EGFR的表达，并与31例正常妊娠妇女做对比，。结果CHM组和PHM组的p57kip2、p53、CD117及EGFR阳性表达率分别为(3.03%、93.94%、87.88%、12.12%)和(83.33%、36.67%、63.33%、36.67%)；CD34分数分别为（12.23±2.27）%、（14.45±2.42）%，CHM组与PHM组差异有统计学意义（P＜0.05），CHM组与正常组差异有统计学意义（P＜0.05），PHM组与正常组无统计学差异（P＞0.05）。结论以免疫组化法检测葡萄胎病理组织中p57kip2、CD34、p53、CD117及EGFR的表达水平，通过其表达水平高低程度，可有效鉴别CHM与PHM。

完全性葡萄胎；部分性葡萄胎；p57kip2；CD34；p53；CD117；EGFR

葡萄胎是育龄期妇女常见的妊娠滋养层疾病，是细胞良性病变，可分为完全性葡萄胎(CHM)和部分性葡萄胎(PHM)。其发生的原因通常为不正常的受精导致，在病理学中表现为滋养叶细胞出现不对称性的增生、绒毛水肿及绒毛间质血管减少。通常年龄在20～30岁之间的妇女为高发人群，约20%左右的CHM可继发成为妊娠滋养细胞疾病，其中2%左右的CHM可发展为妊娠滋养细胞肿瘤，而PHM则极低的概率发展为绒癌[1]。CHM又可分为单亲来源和双亲来源的两种，其中后者没有正常妊娠的可能[2]。因CHM和PHM的恶变率有着显著的差异，有必要将两者准确的鉴别诊断。在临床上通过临床特征、超声、大致形态学和遗传学等不同手段对其进行诊断，但在疾病早期，CHM及PHM的病理学特征不明显，具有隐藏性，所以对两者的鉴别诊断比较困难。本研究通过采用免疫组织化学染色法检测p57kip2、CD34、p53、CD117及 EGFR在 CHM 及PHM的表达差异，可有效的鉴别CHM和PHM，现报告如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2014年3月～2015年3月我院妇科收治的63例葡萄胎患者，纳入标准：经首次清宫后，病理检查确诊为葡萄胎。另选择同期31例正常妊娠妇女为正常组对照。3组一般资料比较无统计学差异（P＞0.05）（表1）。

表1 3组一般资料比较

1.2 方法

1.2.1 标本采集 收集CHM及PHM组患者行子宫或病灶清除后的病变组织，正常组则收集早孕人工流产的绒毛膜细胞作为标本。标本新鲜取材，采用常规酒精梯度脱水，并经二甲苯透明后，进行石蜡包埋。

1.2.2 实验设备与材料 实验仪器为：切片机、电热恒温箱、流式细胞仪、台式微量高速离心机、不同规格的离心管、流式细胞管、微量加样器、显微镜和尼龙过滤网。实验试剂为：DBA酶底物显色试剂盒、二步法抗免疫组化检测试剂盒、SP染色试剂盒（均为上海酶联生物科技有限公司）、胃蛋白酶、二甲苯、PBS磷酸盐缓冲液、无水乙醇、兔抗人多克隆抗体（上海酶联生物科技有限公司）、柠檬酸修复液等。

1.2.3 免疫组化染色方法 （1）组织切片：将石蜡包埋组织在切片机上连续切片5～6张，厚度为4～5 μm；（2）脱蜡：在恒温箱内设定70℃温度烘烤45 min。加入5 ml二甲苯后缓慢摇晃，5 min后再加入同量二甲苯接着摇晃5 min，分两次浸泡在低温的无水乙醇中，每次5 min，无絮状物浮起即可视为脱蜡干净。然后依次加入95%、85%及75%乙醇各5 min，蒸馏水洗涤；（3）离心：加入胃蛋白酶制成的胃液消化液(pH 1.5)5 ml进行消化处理，放置到37℃恒温箱内20 min，取出后加入生理盐水立即终止消化，使用尼龙过滤网过滤。滤液倒入离心管，以2000 r/min离心5 min。上清去掉后，加入PBS磷酸盐缓冲液5 ml进行漂洗。然后以600 r/min离心2 min，然后再加入5 ml PBS磷酸盐缓冲液，如此反复进行5次。加入碘化丙定500 μl，进行10 s的混合摇匀，然后进行30 min的室温避光反应；（4）组织抗原修复：将切片浸入1000 ml抗原修复液(pH 6.0)内，置入微波炉中高火档加热煮沸10 min，自然冷却后用PBS磷酸盐冲洗3次；（5）消除内源性过氧化物物活性：使用3%的H2O2温室孵育15 min，用PBS磷酸盐冲洗3次；（6）滴加一抗50 μl放入4℃冰箱保鲜层孵育过夜，次日取出用PBS磷酸盐冲洗3次；然后加入二抗，37℃恒温箱内孵育15 min，用PBS磷酸盐冲洗3次；（7）显色：清擦组织周围多余水分后，加入DAB溶液，放入显微镜下观察，显色后用自来水洗掉，终止显色；最后使用苏木素进行复染，并用中性树脂进行封片。

1.3 评价标准 对 p57kip2、CD34、p53、CD117及EGFR免疫组化染色阳性时均呈棕黄色，每张切片在高倍镜下(×400)随机选择9个不重叠视野，每视野计数100个细胞。采用半定量评分法，根据每张切片的阳性细胞比例计分：（1）阳性细胞比例＜5%，记0分；（2）阳性细胞比例在5%～25%，记1分；（3）阳性细胞比例在26%～50%，记2分；（4）阳性细胞比例在51%～80%，记3分；（5）阳性细胞比例＞80%，记4分。细胞着色程度计分：细胞无色时，记0分；细胞显淡黄色时，记1分；细胞为棕黄色时，记2分；细胞呈棕褐色时，记3分。两个分数相加得出总分，以此判断结果等级：阴性：得分＜2分；弱阳性：得分为2～3分；阳性：得分为4～5分；强阳性：得分＞5分。采用微血管密度（MVD）计数法对 CD34进行评价，先在100倍显微镜下选取组织内血管最多的区域，然后在400倍下，选取5个视野（染色清晰、背景对照良好）计数微血管数，取平均值作为MVD反映CD34水平。

1.4 统计学方法 应用SPSS 19.0软件处理数据，计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，计数资料以例和率表示，采用χ2检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 p57kip2和p53在3组中的表达比较 CHM组的p57kip2阳性率低于PHM组及正常组（P＜0.01），而p53阳性率高于PHM组及正常组（P＜0.01）；PHM组与正常组比较无统计学差异（P＞0.05），见表2。

表2 p57kip2和p53在3组中的表达比较[n（%)］

2.2 CD34、CD117及EGFR在3组中的表达比较

CHM组的CD34值低于PHM组及正常组 （P＜0.01），CD117阳性率高于PHM组及正常组 （P＜0.05），而EGFR阳性率低于PHM组及正常组（P＜0.01）；PHM组与正常组之间无统计学差异 （P＞0.05）。见表3。

表3 CD34、CD117及EGFR在3组中的表达比较

3 讨论

3.1 葡萄胎的病因 葡萄胎（HM）是发生在育龄期妇女的妊娠滋养细胞上、起源于胎盘绒毛滋养细胞的疾病。其病理学表现为水肿池的形成、绒毛水肿及滋养叶细胞增生，且呈不对称分布，分为CHM和PHM[3]。相关研究认为，HM由于印迹基因功能缺失而导致。印迹基因分为，（1）父系印迹基因：母方染色体基因印迹失活，而父系染色体基因得到表达；（2）母系印迹基因：父方染色体印迹失活，而母系染色体基因得到表达。CHM是仅有两条父系染色体孤雄的两倍体；PHM则是一条母系染色体和两条父系染色体的三倍体[4]。CHM及PHM在病理组织学形态上存在诸多相似特征，鉴别诊断比较困难。CHM继发成为妊娠滋养细胞肿瘤的概率较高，而PHM则有极低的概率可发展为妊娠滋养细胞肿瘤[5]。

3.2 p57kip2、CD34、p53、CD117及 EGFR在葡萄胎中的表达意义 p57kip2是细胞周期素依赖性激酶抑制基因的一个印迹基因，通过免疫组织化学染色可将其作为葡萄胎妊娠的辅助鉴别标志物[6]。在PHM和正常妊娠的绒毛间质细胞内，因母源性等位基因的存在，所以其蛋白呈强性表达；而在CHM中由于其为纯父系来源，缺乏母系的遗传物质，所以，p57kip2在CHM的绒毛膜细胞内缺乏表达。

今发现为止，p53是与人类肿瘤相关性最高的抑癌基因，不仅对细胞生长进行负调节，还可引起细胞程序性死亡[7]。p53缺失突变可导致细胞无限繁殖，从而引发早期的肿瘤形成。因为CHM可继发成为妊娠滋养细胞肿瘤的概率较高，所以，p53也可以作为区分CHM和PHM的标记。

EGFR即血管内皮生长因子，又称血管调理素，其可以增加血管通透性，可加速血管内皮细胞分裂和增殖速度及诱导血管形成等调节滋养细胞作用[8]。其参与对子宫内膜的浸润，从而引发滋养细胞疾病。

CD34属于钙黏蛋白家族成员，其参与细胞活化过程和细胞的增殖与分化，是炎症反应、免疫应答及肿瘤转移等生理病理过程的分子基础[9]。CD117是免疫球蛋白家族成员，当其在CHM中异常表达后，其激活和活化永无停止，且不再受调节，导致自动磷酸化，促进妊娠滋养细胞异常增殖与凋亡抑制，最终形成妊娠滋养细胞肿瘤[10]。

综上所述，检测葡萄胎病理组织中 p57kip2、CD34、p53、CD117及EGFR的表达水平，通过其表达水平高低程度，可有效鉴别CHM与PHM。

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Expression difference of p57kip2,CD34,p53,CD117 and EGFR in CHM and PHM pathological tissues

Liang Shanghua Department of Pathology,Beijing Di'an Clinical Laboratory Co.,Ltd.,Beijing,102600,China

Objective To explore the expression difference of p57kip2,CD34,p53,CD117 and EGFR in complete hydatidiform mole(CHM)and partial hydatidiform mole(PHM)pathological tissues.MethodsA total of 63 hydatidiform mole patients admitted to the Department of Gynaecology of our hospital were retrospectively analyzed and divided into the CHM group(n=33)and the PHM group(n=30).Immunohistochemical staining method was used to detect the expression of p57kip2,CD34,p53,CD117 and EGFR in pathological tissues.The results were compared with those in 31 normal pregnant women.ResultsThe positive expression rate of p57kip2,p53,CD117 and EGFR in the CHM group and the PHM group were(3.03%,93.94%,87.88%and 12.12%)and(83.33%, 36.67%,63.33%and 36.67%)respectively;the percentages of CD34 were(12.23±2.27)%and(14.45±2.42)%respectively.The difference between thee CHM group and the PHM group was significant(P＜0.05).The difference between the CHM group and the normal group was significant,too (P＜0.05).There was no significant difference between the PHM group and the normal group(P＞0.05).ConclusionThe expression levels of p57kip2,CD34,p53,CD117 and EGFR in HM pathological tissues are detected by immunohistochemical method;and the expression levels may be used to effectively distinguish CHM and PHM.

CHM;PHM;p57kip2;CD34;CD117;p53;EGFR

R 714.2

A

1004-0188（2016）12-1425-04

10.3969/j.issn.1004-0188.2016.12.021

2016-06-20）

102600北京，北京迪安临床检验所有限公司病理科

梁尚华，E-mail：1445034065@qq.com