列当多糖对鸡新城疫病毒在鸡成纤维细胞中增殖的抑制作用

阿得力江·吾斯曼，米克热木·沙衣布扎提，阿依姑丽·买买提明，赛福丁·阿不拉

(新疆农业大学动物医学学院，新疆乌鲁木齐 830052)

列当多糖对鸡新城疫病毒在鸡成纤维细胞中增殖的抑制作用

阿得力江·吾斯曼，米克热木·沙衣布扎提，阿依姑丽·买买提明，赛福丁·阿不拉*

(新疆农业大学动物医学学院，新疆乌鲁木齐 830052)

为研究列当多糖抗新城疫病毒(NDV)活性，用水提醇沉法提取列当总多糖及4种分级多糖，并通过苯酚硫酸法及红外光谱对列当多糖进行检测。通过MTT法测定各级多糖对鸡胚成纤维细胞(CEF)的安全浓度。以3种加药方式(先加多糖后接种病毒、先接种病毒后加多糖、多糖和病毒感作后加)加药，检测列当多糖对新城疫病毒的阻断作用、抑制作用及直接杀灭作用。结果表明，列当总多糖及4种分级多糖均具有抗NDV活性，其中对NDV的抑制作用及阻断作用强于对NDV的直接杀灭作用。50%、80%梯度醇沉的列当多糖(OSP50、OSP80)及总多糖(OSPt)，阻断作用下的病毒抑制率分别为19.50%、33.10%和22.30%，抑制作用下的病毒抑制率分别为19.00%、21.90%和22.60%，杀灭作用下对NDV的抑制率分别为，14.70%、17.50%和13.30%，其余各组多糖阻断作用、抑制作用及杀灭作用下的病毒抑制率均低于上述3组多糖。说明OSP50、OSP80及OSPt的抗NDV活性较好，可以作为进一步研究的材料。

列当；多糖；鸡胚成纤维细胞；新城疫病毒

鸡新城疫(Newcastle disease,ND)是对我国养鸡业危害严重、经济损失巨大的禽病之一，至今对于此病的治疗仍无有效的药物。研究显示植物多糖具有无毒、无害、无残留、无抗药性等特点，能提高机体免疫功能，同时具有抗病毒、免疫调节及增殖、抗肿瘤等多种药理作用[1]。列当(OrobanchecoerulescensSteph.)是新疆及周边地区常见的一种植物，也是一种传统药物。中药学中列当全草入药，具有补肾、强筋之功效，用于治疗肾虚、腰膝冷痛、遗精等症状[2]。维吾尔医学中列当通常用于治疗腹泻、阳痿、消化不良等疾病[3]。研究表明，列当含多糖、苯乙醇苷类、木脂素类、甾醇类及环烯醚萜类等多种化学成分[4-5]。刘东春等进行列当水提物药效学研究，结果显示列当能使小鼠巨噬细胞增殖，从而增加网状内皮系统巨噬细胞的吞噬廓清能力和速度，起到增强免疫作用[6]。目前关于列当抗病毒作用的研究鲜有报道，为考察列当多糖体外抗病毒效果，本试验用MTT法检测列当多糖对新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)感染鸡胚成纤维细胞(chicken embryo fibroblast，CEF)的影响，旨在筛选出列当抗病毒效果较好的活性部位。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 新城疫病毒制备 鸡新城疫中等毒力活疫苗(Ⅰ系)，吉林正业生物制品股份有限公司产品(批号2013002)；9日龄SPF鸡胚，北京梅里亚维通实验动物技术有限公司；接种48 h后收集尿囊液，离心得病毒液，测定血凝效价，病毒传3代后用Reed-Muench法[7]测定病毒对CEF的半数组织培养感染剂量(TCID50)为10-7，临用前用细胞维持液稀释成10-5(100 TCID50)

1.1.2 主要试剂 Hank′s液，HyClone公司产品；双抗，美国Genview公司产品；DMEM培养液，Hy Clone公司产品；小牛血清，江苏恩莫阿赛生物技术有限公司产品；四甲基偶氮唑蓝MTT溶液，Biosharp公司产品；胰蛋白酶，北京索莱宝生物科技有限公司产品。

1.1.3 主要仪器 CO2培养箱，美国Eppendorf公司；TE2000-U型倒置显微镜，Nikon公司产品；SHE-3000型酶标分析仪，北京赛尔福知心科技有限公司；MM-2型微量振荡器，金坛市医疗仪器厂；TU-1901双光束紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；G154TW高压灭菌锅，上海富士工器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 列当多糖的提取 列当，粉碎，过60目筛，用95%无水乙醇回流3次进行脱脂，脱脂后的列当在80 ℃、1∶15料水比下水煮3次，取上清液减压浓缩，上清液经Sevage法除蛋白后，加无水乙醇分别提取(30%、50%、70%、80%分步沉淀多糖及80%一步沉淀多糖即(OSP30、OSP50、OSP70、OSP80及OSPt)，取沉淀用90%的乙醇、无水乙醇及丙酮溶液反复洗涤数次得干燥的粗多糖。

1.2.2 列当多糖的制备 采用苯酚-硫酸法建立标准曲线并测定(OSP30、OSP50、OSP70、OSP80和OSPt)列当多糖的含量[8]。通过公式：多糖含量(%)=C×D÷W×100%(C为所测OSP的浓度，D为稀释因素，W为样品量)计算多糖含量。再将OSP30、OSP50、OSP70、OSP80和OSPt，用PBS配制、高压、0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存备用。

1.2.3 列当多糖的红外光谱检测 列当多糖样品用KBr压片法制备，利用红外光谱法进行扫描观察。

1.2.4 列当多糖安全浓度测定 将制备好的列当多糖分别自5 mg/mL浓度用细胞维持液倍比稀释成11个浓度梯度。待细胞长成单层后，弃去细胞培养液，用Hank′s液洗2次，加药，每孔100 μL，每个浓度重复4孔，同时以细胞维持液为对照孔。培养72 h后，按MTT法用酶联免疫检测仪于490 nm波长处测定OD490nm值。选择OD490nm值不小于细胞对照组的最大浓度作为该多糖的最大安全浓度。

假定理想状态下，溶洞范围很大，溶洞顶、底面均为水平。片石黏土组成的圆台外表面将呈斜面，因黏土在钻锤冲砸时基本成流塑状态，未发生固结，其粘聚力可不考虑，圆台外斜面斜率与片石内摩擦角相关，约为30°，可依此进行估算。圆台顶部直径跟锤击能量相关，根据过往施工经验，顶部直径约为桩孔直径的3～5倍，本工程施工最终阶段采用高锤重击，顶部直径按5倍桩孔直径考虑。由此得出片石黏土抛填量的估算半径，r为圆台顶半径，h为圆台高度。此为溶洞顶底基本水平、溶腔范围很大的情况下的估算值，其余类型溶洞的填充量计算可以参考此式。

1.2.5 列当多糖抗NDV感染细胞作用的影响 将各多糖用细胞维持液分别从安全浓度向下依次倍比稀释5个浓度。待CEF长成单层后，弃掉孔内液体，用Hank′s液洗3次，以3种方式加入各浓度多糖和病毒即:先加多糖后接种病毒:每孔加入不同浓度的多糖100 μL，培养4 h后弃掉孔内液体，加入病毒液100 μL。先接种病毒后加多糖:每孔加入病毒液100 μL，培养2 h后弃掉孔内液体，加入多糖100 μL。多糖和病毒感作后加入:将病毒液分别加入到各浓度的多糖溶液中37 ℃作用4 h，再加入到培养板中。3种加药方式的细胞均培养72 h后，按MTT法测定OD490nm值，并按以下公式计算病毒抑制率[9]：病毒抑制率=(OD(多糖+病毒)-OD病毒对照)/(OD细胞对照-OD病毒对照)×100%。

1.2.6 统计分析 计算4孔平均值和标准差，数据以Means±SE表示，用SPSS21.0软件进行One-way ANONA 方差分析，方差显著性用Duncan′s多重比较检验，以P<0.05作为差异显著性判断标准。

2 结果

2.1 标准曲线的建立及列当多糖含量测定

以吸光度(OD)为纵坐标，葡萄糖浓度(C)为横坐标进行回归，得回归方程OD=2.4 C-0.0013，相关系数R2=0.999 5。通过计算的列当多糖OSP30、OSP50、OSP70、OSP80、OSPt的含量分别为24.95%、37.01%、34.61%、24.08%、30.36%，粗多糖得率分别为6.11%、1.73%、1.94%、1.63%、12.14%(图1)。

图1 葡萄糖标准曲线

2.2 列当多糖的红外光谱分析

列当多糖具有多糖的特征吸收峰，OSP30、OSP50、OSP70、OSP80、OSPt均在3 200～3 600 cm-1之间有强吸收峰，为多糖O-H基的伸缩振动引起，在2 800～3 000 cm-1处的中强吸收峰，为(-CH2-)C-H的伸缩振动，以上2个区域的吸收峰是糖类的特征峰。1 600～1 872 cm-1之间的强吸收峰为-COOH的C=O非对称伸缩振动吸收峰。1 300～1 465 cm-1之间的吸收峰为羟基吸收峰，C-O伸缩振动,C-H变角振动，1 000～1 100 cm-1之间的吸收峰为处是C-O的伸缩振动,说明多糖含有吡喃环。根据以上特征峰，可判定提取物是多糖类化合物(图2)。

2.3 列当多糖对CEF细胞最大安全浓度的测定

各级多糖从初始浓度5 000 μg/mL起，OSP30、OSPt在1 250 μg/mL～5 000 μg/mL，OSP50、OSP70、OSP80在2 500 μg/mL～5 000 μg/mL时的OD490值均显著小于细胞对照组(P<0.05)。说明该浓度时多糖对CEF有毒性作用。A490值越小，表明多糖对CEF的毒性越大。OSP30、OSPt在625 μg/mL，OSP50、OSP70和OSPt在1250 μg/mL时的A490值不显著小于细胞对照组(P>0.05)。因此将该浓度定为他们的最大安全浓度，为了便于同水平比较，各多糖的安全浓度统一定为625 μg/mL。安全浓度以下，OSP30、OSP50在78.125 μg/mL，OSP70、OSP80在19.53 μg/mL～156.25 μg/mL，OSPt在78.125 μg/mL～156.25 μg/mL时的细胞OD490值显著高于细胞对照组(P<0.05)，表明此浓度下多糖能显著促进CEF的生长(表1)。

图2 列当多糖的红外图谱

表1 在4.883 μg/mL～5 000 μg/mL范围内各多糖组细胞的OD490值

Table 1 OD490 value of every polysaccharide groups within 4.883 μg/mL-5 000 μg/mL

浓度/(μg·mL-1)ConcentrantionOSP30OSP50OSP70OSP80OSPt50000.332±0.017d0.345±0.023d0.335±0.022e0.341±0.021g0.303±0.005e25000.409±0.014c0.417±0.022c0.404±0.019d0.404±0.017f0.408±0.016d12500.416±0.015c0.457±0.023b0.460±0.020c0.458±0.028de0.418±0.014d6250.454±0.021b0.464±0.019ab0.465±0.021bc0.469±0.013cde0.467±0.021bc312.50.465±0.023b0.476±0.013ab0.474±0.019bc0.475±0.021bcde0.480±0.010b156.250.469±0.013b0.479±0.028ab0.492±0.022ab0.510±0.015ab0.505±0.015a78.1250.500±0.015a0.495±0.022a0.510±0.016a0.514±0.017a0.504±0.014a39.060.467±0.006b0.479±0.005ab0.516±0.009a0.505±0.018abc0.481±0.013b19.530.461±0.019b0.474±0.013ab0.493±0.015ab0.491±0.028abcd0.475±0.007bc9.7650.456±0.021b0.469±0.010ab0.468±0.025bc0.459±0.033de0.463±0.015bc4.8830.455±0.016b0.453±0.018b0.459±0.011c0.455±0.027de0.460±0.016bc细胞对照Cellcontrol0.456±0.025b0.453±0.019b0.460±0.025c0.453±0.031e0.460±0.016bc

注：同列数据标注不同字母者表示差异显著(P<0.05)。

Note:Column data marked with different superscripts differ significantly (P<0.05).

2.4.1 先加多糖后接种病毒时NDV感染CEF的能力 OSP30、OSP50在78.125 μg/mL～312.5 μg/mL，OSP70在312.5 μg/mL，OSP80在39.06 μg/mL～312.5 μg/mL、OSPt在156.25 μg/mL～312.5 μg/mL时的OD490值显著大于病毒对照组(P<0.05)，说明该浓度时他们能阻断NDV感染CEF。各级多糖中OSP30、OSP70浓度为312.5 μg/mL时，OSP50、OSP80和OSPt浓度为156.25 μg/mL时的阻断作用最强。说明列当多糖浓度在156.25 μg/mL～312.5 μg/mL之间阻断NDV感染CEF的能力最强(表2)。

列当多糖对NDV的抑制率，各组多糖对NDV均有抑制作用，各组间抑制率有显著差异(P<0.05)，其中OSP80组最高，达33.10%。其次为OSPt、OSP50、OSP30、OSP70，抑制率分别为22.30%、19.50%、15.10%、10.80%(图3)。

2.4.2 先接种病毒后加多糖时NDV感染CEF的能力 OSP30、OSP80在78.125 μg/mL～625 μg/mL，OSP50、OSP70在78.125 μg/mL～312.5 μg/mL，OSPt在39.06 μg/mL～625 μg/mL时的OD490 nm值显著大于病毒对照组(P<0.05)，说明能抑制NDV感染CEF。各级多糖中OSP30、OSP50、OSP80、OSPt浓度为312.5 μg/mL、OSP70浓度为156.25 μg/mL时的OD490 nm值最大，此浓度下的抑制力最强(表3)。

表2 先加多糖时各组细胞的OD490 nm值

Table 2 The cellular OD490 nm values of every groups in pre-adding OSP

浓度/(μg·mL-1)ConcentrantionOSP30OSP50OSP70OSP80OSPt6250.136±0.003cd0.136±0.004cd0.128±0.006c0.136±0.006cd0.130±0.005c312.50.166±0.007b0.141±0.005c0.165±0.014b0.194±0.009b0.179±0.012b156.250.144±0.004c0.189±0.012b0.138±0.005c0.199±0.011b0.188±0.007b78.1250.143±0.004c0.143±0.007c0.133±0.004c0.150±0.008c0.145±0.003c39.060.135±0.005cd0.136±0.006cd0.130±0.003c0.146±0.007c0.129±0.005c病毒对照Viruscontrol0.126±0.004d0.126±0.004d0.126±0.004c0.126±0.004d0.129±0.005c细胞对照Cellcontrol0.244±0.009a0.244±0.009a0.244±0.009a0.244±0.009a0.242±0.011a

注：同列数据标注不同字母者表示差异显著(P<0.05。

Note:Column data marked with different superscripts differ significantly (P<0.05).

不同字母表示差异显著(P<0.05

Different superscripts differ significantly (P<0.05)

图3 先加多糖后接种病毒时各组的病毒抑制率

Fig.3 The virus inhibitory rate of every group in pre-adding polysaccharides

列当多糖对NDV的抑制率，各组多糖对NDV均有抑制作用，各组间抑制率无显著性差异，其中OSPt组最高，达22.60%。其次为OSP80、OSP50、OSP30、OSP70，分别为21.90%、19.00%、18.90%和18.30%(图4)。

不同字母表示差异显著(P<0.05

Different superscripts differ significantly (P<0.05)

图4 先接种病毒后加多糖时各组的病毒抑制率

Fig.4 The virus inhibitory rate in post-adding polysaccharides

表3 后加多糖时各组细胞的OD490 nm值

Table 3 The cellular OD490 nm values of every groups in post-adding OSP

浓度/(μg·mL-1)ConcentrantionOSP30OSP50OSP70OSP80OSPt6250.166±0.010c0.164±0.012cd0.163±0.006cd0.176±0.006bc0.173±0.011c312.50.192±0.008b0.189±0.010b0.174±0.012c0.189±0.010b0.189±0.010b156.250.187±0.014b0.181±0.009b0.193±0.003b0.177±0.008bc0.188±0.005b78.1250.164±0.011c0.176±0.011bc0.173±0.008c0.173±0.005c0.177±0.008bc39.060.152±0.018d0.155±0.007d0.158±0.008d0.165±0.008cd0.164±0.013c病毒对照Viruscontrol0.153±0.014d0.153±0.014d0.153±0.014d0.153±0.014d0.149±0.008d细胞对照Cellcontrol0.258±0.012a0.258±0.012a0.258±0.012a0.258±0.012a0.278±0.011a

注：同列数据标注不同字母者表示差异显著(P<0.05。

Note:Column data marked with different superscripts differ significantly (P<0.05).

2.4.3 多糖和病毒混合作用后加入时NDV感染CEF的能力 OSP30的OD490 nm值均不显著小于细胞对照组(P>0.05)，说明OSP30对NDV基本上无杀灭作用。OSP50、OSPt在156.25 μg/mL～312.5 μg/mL，OSP70在39.06 μg/mL～312.5 μg/mL，OSP80在78.125 μg/mL～312.5 μg/mL时的OD490 nm值显著大于病毒对照组(P<0.05)，说明该浓度时的多糖对NDV有杀灭作用。各级多糖中OSP30、OSP70浓度为156.25 μg/mL时，OSP50、OSP80、OSPt在312.5 μg/mL时的OD490 nm值最大，说明此浓度下的杀灭作用最强(表4)。列当多糖对NDV的抑制率，其中OSP80组最高，为17.50%。其次为OSP50、OSPt、OSP70和OSP30，分别为14.70%、13.30%、11.00%和7.10%(图5)。

表4 多糖和病毒混合作用时细胞的OD490 nm值

Table 4 The cellular OD490 nm values of every groups in mixed adding OSP with NDV

浓度/(μg·mL-1)ConcentrantionOSP30OSP50OSP70OSP80OSPt6250.157±0.012b0.165±0.014bc0.159±0.008c0.165±0.006bc0.162±0.007c312.50.158±0.009b0.175±0.011b0.164±0.008b0.181±0.010b0.185±0.008b156.250.168±0.009b0.173±0.007b0.173±0.014b0.178±0.014b0.184±0.011b78.1250.163±0.009b0.171±0.013bc0.170±0.013b0.174±0.016b0.177±0.019bc39.060.161±0.007b0.168±0.017bc0.166±0.011b0.170±0.012bc0.164±0.014bc病毒对照Viruscontrol0.153±0.013b0.153±0.013c0.153±0.013c0.153±0.013c0.159±0.018c细胞对照Cellcontrol0.271±0.015a0.271±0.015a0.271±0.015a0.271±0.015a0.275±0.020a

注：同列数据标注不同字母者差异显著(P<0.05。

Note:Column data marked with different superscripts differ significantly (P<0.05).

不同字母表示差异显著(P<0.05

Different superscripts differ significantly (P<0.05)

图5 多糖和病毒混合作用后加入时各组的病毒抑制率

Fig.5 The virus inhibitory rate in mixed adding polysaccharides with NDV

3 讨论

列当具有免疫调节、抗氧化、镇静及抗炎等多种药理作用[10]，而其抗病毒作用未见报道。MTT比色法常用于检测细胞增值及细胞毒性，其OD值能够直接反映出被检测细胞的活性或增值情况，在一定范围内OD值同细胞活性呈正相关[11]。本试采用水提醇沉法提取OSP30、OSP50、OSP70、OSP80分步多糖及OSPt一步多糖，并用苯酚硫酸法检测糖含量，用红外光谱对多糖进行分析。考虑到多糖对细胞生长的影响及毒性作用，首先对列当多糖进行安全浓度的测定，在安全浓度及以下4个浓度，用3种加药方式，检测了列当多糖抗NDV的效果。通过计算病毒抑制率得知了各级多糖抗病毒活性的大小。王君敏等[9]检测枸杞多糖对新城疫病毒感染鸡胚成纤维细胞能力的影响。结果表明枸杞多糖先加多糖后接种病毒及多糖和病毒混合作用时的病毒抑制率在15%～20%之间，而先接种病毒后加多糖的病毒抑制率则低于10%。蒋月等[12]通过三种给药方式检测桦褐孔菌多糖的抗NDV效果，研究显示，桦褐孔菌多糖对NDV有一定的预防及治疗作用，其中通过多糖和病毒混合时的抗病毒活性最强。为检测列当多糖能否通过吸附或进入细胞，起到抗病毒作用，用先加多糖后上病毒的方式。结果证明OSP30、OSP50、OSP70、OSP80及OSPt均对NDV具有较好的预防作用，其中OSP80及OSPt的病毒抑制率较高，分别为33.10%、22.30%。为检测多糖能否对以进入细胞的NDV有抑制合成或释放毒素的作用，通常用先加病毒后上多糖的方式。结果证明五组多糖均对NDV具有较好的治疗作用，其中OSPt的病毒抑制率最高，为22.60%。为检测多糖能否减弱或杀灭病毒活性，通常用多糖和病毒混合一段时间后再作用于细胞的方式。结果证明五组多糖均对NDV具一定的杀灭作用，但杀灭作用都不强，其中OSP80的病毒抑制率最高，为17.50%。

综上所述，列当多糖对NDV的抑制作用及阻断作用强于对NDV的直接杀灭作用，其中OSP50、OSP80及OSPt的抗NDV活性较好，可以作为进一步研究的材料。

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Study on Antiviral Effect of Polysaccharides fromOrobanchecoerulescenson NDVinVitro

ADELIJIANG-Wusiman,MUKEREMU-Shayibuzhati,AYIGULI-maimaitiming,SAIFUDING-Abula

(CollegeofVeterinaryMedicine,XinjiangAgriculturalUniversity,Urumqi，Xinjiang，830052,China)

To research on polysaccharides fromOrobanchecoerulescensagainst Newcastle disease virus (NDV),total polysaccharide and four different solvent extraction ofOrobanchecoerulescenswere extracted by the methods of hot water extraction and ethanol precipition in this study.The content of polysaccharide was measured by phenol-sulfuric acid method and infrared spectroscopy method.The safe concentration and growth of chick embryo fibroblasts (CEF) were assayed by MTT method in order to facilitate the comparison under the same level,the safe concentration was united as 625 μg/mL.Under the safety range of concentration, the block-virus activity,anti-virus activity and virus-killing activity of polysaccharides were detected through the way of pre-adding polysaccharides,post-adding polysaccharides and adding polysaccharides with NDV.Results showed that the direct inactivation and propagation inhibition activity of total polysaccharide and four different solvent extraction were stronger than anti-absorption function.Block-virus activity rate of 50%,80% gradient alcohol precipitation of polysaccharides fromOrobanchecoerulescens(OSP50,OSP80) and total polysaccharide (OSPt)were 19.50%,33.10%,22.30%,anti-virus inhibition rate were 19.00%,21.90% and 22.60%,virus-killing inhibition rate were 14.70%,17.50%,13.30%.The activity rate of this three polysaccharides were higher than that of other polysaccharides fromOrobanchecoerulescens.In summary,50%,80% gradient alcohol precipitation and total polysaccharide in this five polysaccharides possessed better activity and would be as the materials for further research.

Orobanchecoerulescens；polysaccharide；chick embryo fibroblast；Newcastle disease virus

2016-05-19

国家自然科学基金项目(31360625)

阿得力江·吾斯曼(1990-)，男(维吾尔族)，硕士研究生，主要从事中药药理学研究。*通讯作者

S853.73

A

1007-5038(2016)12-0060-06