丹酚酸A、B组分配伍对HK-2细胞CCL2、CXCL10及氧化应激反应的影响

李均，陈雨思，邹朝霞

(遵义医学院珠海校区，广东珠海519000)

丹酚酸A、B组分配伍对HK-2细胞CCL2、CXCL10及氧化应激反应的影响

李均，陈雨思，邹朝霞

(遵义医学院珠海校区，广东珠海519000)

目的 观察丹酚酸A、B组分配伍对HK-2肾小管上皮细胞肾纤维化模型炎症趋化因子2(CCL2)、CXC趋化因子配体 10(CXCL10)及氧化应激反应的影响，探讨丹酚酸A、B组分配伍对肾纤维化的治疗作用机制。方法 培养HK-2细胞，分为正常组、模型组、丹酚酸A组、丹酚酸B组、丹酚酸A+B组。模型组、丹酚酸A组、丹酚酸B组、丹酚酸A+B组均制备肾纤维化细胞模型。丹酚酸A组加入丹酚酸A 20 μmol/L，丹酚酸B组加入丹酚酸B 20 μmol/L，丹酚酸A+B组加入丹酚酸A、B各10 μmol/L，模型组及正常组不干预。各组均分别培养24、48、72 h。应用酶联免疫吸附法检测上清液CCL2、CXCL10水平，应用水溶性四唑盐法、二硫代二硝基苯甲酸法检测上清液SOD、GSH水平，应用硫代巴比妥酸法检测细胞内MDA水平。结果 模型组各时点上清液CCL2、CXCL10、GSH、MDA水平均高于正常组，SOD水平均低于正常组(P均<0.05)。丹酚酸A组、丹酚酸B组、丹酚酸A+B组各时点上清液CCL2、CXCL10、GSH、MDA水平均低于模型组，SOD水平均高于模型组(P均<0.05)。丹酚酸A+B组各时点上清液CCL2、CXCL10、GSH、MDA水平均低于丹酚酸A组及丹酚酸B组，SOD水平均高于丹酚酸A组及丹酚酸B组(P均<0.05)。结论 丹酚酸A、B组分配伍可抑制HK-2细胞炎症趋化因子CCL2、CXCL10的表达，在抗炎及抗氧化方面的效果优于单一组分应用，二者配伍应用对肾纤维化具有协同治疗作用。

肾小管上皮细胞；肾纤维化；丹酚酸；单核细胞趋化蛋白-1；炎症趋化因子；超氧化物歧化酶；丙二醛

肾纤维化是不同类型的慢性肾脏病发展为终末期肾病(ESRD)时的病理表现，最终将导致肾单位发生不可逆的破坏。由于肾脏受到损伤、感染、免疫复合物的沉积及血液循环障碍等各种致病因素的刺激，促使肾固有细胞释放炎症趋化因子2(CCL2)、单核细胞趋化蛋白3 (CCL7)、CXC趋化因子配体 10(CXCL10)等，发生趋化炎症细胞的浸润，引起肾脏炎症损伤，促进促纤维化因子的释放，最终导致肾纤维化[1,2]。丹参总酚酸是从唇形科植物丹参的干燥根及根茎中经加工制成的提取物，具有增加肾血流量、抑制Janus激酶/信号转导及转录激活子(JAS/STATs)通路、清除氧自由基、改善微循环、抗血小板聚集等作用。丹参提取成分包括脂溶性成分和水溶性成分，其中水溶性成分主要包括丹酚酸A、丹酚酸B和丹酚酸C。研究表明，丹酚酸A具有改善肾血流量、降低尿白蛋白的作用；丹酚酸B具有很强的抗氧化及抑制炎症反应的作用，在抗肝肾纤维化方面有重要作用[3]。本课题组前期研究证实，丹酚酸A、B组分配伍能显著抑制大鼠肾组织 CTGF的表达、促进细胞极性蛋白3(Par-3)的表达，其效果优于丹酚酸A和丹酚酸B单独应用。但是，丹酚酸 A、B组分配伍应用对肾脏炎症反应及氧化应激反应的影响尚不明确。2015年，我们观察了丹酚酸A、B组分配伍对人肾小管上皮细胞CCL2、CXCL10的调节及抗氧化作用，探讨丹酚酸A、B组分配伍对肾纤维化的治疗机制。

1 材料与方法

1.1 细胞及试剂 人肾小管上皮HK-2细胞购自广州吉妮欧生物有限公司。丹酚酸A、B(上海融禾医药公司)；人血清白蛋白(美国Sigma合肥博美生物科技有限公司)；人CCL2、CXCL10酶联免疫分析试剂盒(美国R&D广州杰特伟生物科技有限公司)；超氧化物歧化酶(SOD)、还原型谷胱甘肽(GSH)、细胞丙二醛(MDA)测定试剂盒(南京建成生物科技有限公司)。

1.2 细胞培养及分组 在含5%CO2、37 ℃恒温培养箱中，用含10%胎牛血清的1640培养基培养HK-2细胞，每1～2天换液1次，每3～5天细胞传代1次。在显微镜下观察细胞长到80%～90%时，用无血清培养基同步化24 h后，随机分为正常组、模型组、丹酚酸A组、丹酚酸B组、丹酚酸A+B组。每组设3个复孔。

1.3 造模及干预方法 模型组、丹酚酸A组、丹酚酸B组、丹酚酸A+B组均加入含40 mg/mL人血清白蛋白的10%胎牛血清培养基制备肾纤维化细胞模型，正常组加入含10%胎牛血清的培养基。丹酚酸A组加入丹酚酸A 20 μmol/L，丹酚酸B组加入丹酚酸B 20 μmol/L，丹酚酸A+B组加入丹酚酸A、B各10 μmol/L，模型组及正常组不干预。各组均分别培养24、48、72 h。

1.4 细胞上清液CCL2、CXCL10、SOD、GSH及细胞内MDA水平检测 收集24、48、72 h时各组的上清液及细胞，应用酶联免疫吸附法测定上清液CCL2、CXCL10水平，应用水溶性四唑盐法、二硫代二硝基苯甲酸法检测上清液SOD、GSH水平，应用硫代巴比妥酸法检测细胞内MDA水平。

2 结果

2.1 各组细胞上清液CCL2水平比较 模型组各时点上清液CCL2水平均高于正常组(P均<0.05)。丹酚酸A组、丹酚酸B组、丹酚酸A+B组各时点上清液CCL2水平均低于模型组(P均<0.05)，丹酚酸A+B组各时点上清液CCL2水平均低于丹酚酸A组及丹酚酸B组(P均<0.05)。见表1。

表1 各组细胞上清液CCL2水平比较

注：与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，△P<0.05；与丹酚酸A+B组比较，#P<0.05。

2.2 各组细胞上清液CXCL10水平比较 模型组各时点上清液CXCL10水平均高于正常组(P均<0.05)。丹酚酸A组、丹酚酸B组、丹酚酸A+B组各时点上清液CXCL10水平均低于模型组，丹酚酸A+B组各时点上清液CXCL10水平均低于丹酚酸A组及丹酚酸B组(P均<0.05)。见表2。

表2 各组细胞上清液CXCL10水平比较

注：与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，△P<0.05；与丹酚酸A+B组比较，#P<0.05。

2.3 各组上清液GSH水平比较 模型组各时点上清液GSH水平均低于正常组(P均<0.05)。丹酚酸A组、丹酚酸B组、丹酚酸A+B组各时点上清液GSH水平均高于模型组(P均<0.05)，丹酚酸A+B组各时点上清液GSH水平均高于丹酚酸A组及丹酚酸B组(P均<0.05)。见表3。

表3 各组上清液GSH水平比较

注：与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，△P<0.05；与丹酚酸A+B组比较，#P<0.05。

2.4 各组上清液SOD水平比较 模型组各时点上清液SOD水平均低于正常组(P均<0.05)。丹酚酸A组、丹酚酸B组、丹酚酸A+B组各时点上清液SOD水平均高于模型组(P均<0.05)。丹酚酸A+B组各时点上清液SOD水平均高于丹酚酸A组及丹酚酸B组(P均<0.05)。见表4。

表4 各组上清液SOD水平比较

注：与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，△P<0.05；与丹酚酸A+B组比较，#P<0.05。

2.5 各组细胞内MDA水平比较 模型组各时点上细胞MDA水平均高于正常组(P均<0.05)。丹酚酸A组、丹酚酸B组、丹酚酸A+B组各时点细胞MDA水平均低于模型组(P均<0.05)。丹酚酸A+B组各时点细胞MDA水平均低于丹酚酸A组及丹酚酸B组(P均<0.05)。见表5。

表5 各组细胞内MDA水平比较

注：与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，△P<0.05；与丹酚酸A+B组比较，#P<0.05。

3 讨论

肾纤维化是各种慢性肾脏病发展为ESRD的病理表现，其病理机制的形成可分为四个阶段，首先是细胞被激活、受损阶段，单核细胞、肾小管上皮细胞等被激活并在间质释放促炎因子；第二阶段以释放促纤维化因子为特征；第三阶段为细胞外基质(ECM)合成增多并降解减少，在间质堆积；第四阶段为肾单位被破坏，数量逐渐下降，肾功能持续降低[2]。彭晖等[4]在体外用人血清白蛋白对近端肾小管上皮细胞进行干预，发现趋化因子和炎症细胞在肾小管聚集，导致肾小管细胞进一步损伤和破坏，最后进展为肾纤维化。因此，炎症趋化因子的释放是肾纤维化发展必不可少的阶段，减少炎症趋化因子的释放对于防治肾纤维化进展具有重要意义。

炎症趋化因子是一类功能相似、具有趋化作用的分泌性促炎因子，根据其N端半胱氨酸(Cys)位置的不同，可分为四种：C、CC、CXC、CX3C。其中CCL2属于CC类，CXCL10属于CXC类。CC类趋化因子主要由巨噬细胞核和内皮细胞产生，其主要作用是诱导单核巨噬细胞、淋巴细胞等细胞的迁移和活化，参与炎症反应。CXC类趋化因子主要参与中性粒细胞的活化[5]。在肾纤维化的发展过程中，炎症趋化因子如CCL2、IL-6等大量产生，可促进炎症细胞迁移到损伤部位，大量释放促纤维化因子，使肾脏固有细胞发生转分化，合成大量的Ⅳ型胶原蛋白、层黏连蛋白，导致细胞外基质沉积，加重肾小管的破坏[6]。Kashyap等[7]研究发现，在小鼠肾血管高血压模型中，阻断CCL2/CCR2通路中的CCR2可以减少巨噬细胞的浸润，延缓慢性肾损害的发展[10]。赵艳等[8]研究发现，通过p38 MAPK/核因子κB(NF-κB)途径下调CCL2的表达后，可通过抑制炎症反应发挥对肾脏的保护作用。Furuichi等[9]研究发现，CXCL10在肾缺血-再灌注损伤模型中可促进肾小管细胞的增殖。本研究发现，模型组24、48、72 h时细胞上清液CCL2、CXCL10水平均高于正常组，提示肾纤维化过程中趋化因子CCL2、CXCL10表达增加，可能参与了肾纤维化过程。

氧化应激在肾纤维化的发生、发展过程中发挥重要作用。活性氧簇(ROS)可使肾单位毛细血管基底膜脂质过氧化增加血管通透性，破坏肾单位的结构屏障和电荷屏障，导致肾损伤。研究发现，ROS 可以作为第二信使激活NF-κB信号途径，促进炎症细胞的浸润与活化，释放炎性趋化因子如CCL2、IL-1等，炎症趋化因子又进一步吸引单核巨噬细胞、白细胞等炎症细胞趋化迁移到损伤部位，形成恶性循环，促进肾纤维化的形成[10,11]。SOD、GSH是体内重要的氧自由基清除剂，SOD参与O2-转换成H2O2的反应，GSH参与H2O2转化成H2O的反应，从而发挥清除体内氧自由基的作用。当SOD活性下降时，可使脂质过氧化生成的MDA增加，MDA能使膜蛋白与磷脂产生交联聚合，直接破坏细胞质膜的磷脂双层结构，导致膜蛋白的失活，细胞膜丧失功能，诱导细胞发生凋亡[12]。付碧琼等[13]研究发现，通过增加SOD活性、减少MDA含量可发挥抗氧化应激作用，抑制高糖诱导的肾小管上皮细胞应激性衰老。本研究发现，模型组 24、48、72 h时SOD、GSH水平均降低，MDA水平均升高，提示肾纤维化过程中能清除自由基的SOD、GSH水平降低，具有细胞毒性的MDA水平升高，可能与炎性趋化因子共同参与了肾纤维化的发生发展有关。

丹参为唇形科植物丹参的干燥根和根茎，具有活血祛瘀、通经止痛、清心除烦、凉血消痈的功效。丹参及其复方制剂在临床上广泛用于治疗各种心脑血管疾病。丹参的化学成分包括水溶性成分酚酸类和脂溶性成分二萜醌类，其中水溶性成分均具有酚酸性结构，有抗氧化、改善脑缺血再灌注损伤、抗凝血、抗肿瘤等作用。范华英等[14]研究发现，丹酚酸A能减少阿霉素肾病患者肾组织中巨噬细胞、中性粒细胞的浸润，降低炎症因子如血管细胞黏附分子、CCL2 、IL-6水平，抑制NF-κB表达。王巍巍等[15]研究发现，丹酚酸B能通过下调TGF-β的表达抑制p-p38 MAPK的过表达，从而减轻马兜铃酸诱导的人肾小管上皮细胞凋亡、转分化及炎细胞浸润等病变。

与单一组分应用相比，组分配伍在减少炎症趋化因子的释放及增加SOD活力的效果优于单一成分。本课题组前期研究发现，丹酚酸B、C组分配伍应用可降低大鼠CCL2、CCL3蛋白的表达，改善大鼠肾功能和肾脏病理改变，对肾脏有一定的保护作用。但目前对丹酚酸A、B组分配伍对肾纤维化的治疗作用机制尚不明确。本研究发现，丹酚酸A组、丹酚酸B组各时点上清液CCL2、CXCL10水平均低于模型组，GSH、SOD水平均高于模型组，细胞MDA水平低于模型组，提示丹酚酸A、B可能通过减少抑制炎症趋化因子CCL2、CXCL10的表达而发挥抗炎作用，从而促进抗氧化作用，发挥肾保护作用；丹酚酸A+B组各时点上清液CCL2、CXCL10水平、细胞MDA水平均低于丹酚酸A组及丹酚酸B组，GSH、SOD水平均高于丹酚酸A组及丹酚酸B组，提示丹酚酸A及丹酚酸B组分配伍应用可协同抑制炎症趋化因子CCL2、CXCL10的表达，在抗炎及抗氧化方面的效果优于单一组分应用，丹酚酸A、B组分配伍应用对肾纤维化可能具有协同治疗作用。

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Effect of compatibility of salvianolic acid A, B on CCL2, CXCL10 expression and oxidative stress reaction of HK-2 cells

LIJun,CHENYusi,ZOUZhaoxia

(ZhuhaiCampusofZunyiMedicalUniversity,Zhuhai519000,China)

Objective To observe the effect of compatibility of salvianolic acid A and B on the expression of monocyte chemoattractant protein-1 (CCL2), CXC chemokine ligand 10 (CXCL10) and oxidative stress reaction in renal fibrosis model cells HK-2, and to explore the protective effect of salvianolic acid A and B on renal fibrosis. Methods HK-2 cells were cultured and then were divided into the normal group, model group, salvianolic acid A group, salvianolic acid B group, and salvianolic acid A + B group. The renal fibrosis cell models were all prepared in the model group, salvianolic acid A group, salvianolic acid B group, and salvianolic acid A + B group. The salvianolic acid A group was added with 20 μmol/L salvianolic acid A, the salvianolic acid B group with 20 μmol/L salvianolic acid B, the salvianolic acid A+B group with 10 μmol/L salvianolic acid A, B, and the model group and normal group were not interfered. Each group was cultured for 24, 48, and 72 h. The levels of CCL2 and CXCL10 in the supernatant was determined by enzyme linked immunosorbent assay, the levels of SOD and GSH in supernatant were detected by water WST-1 method and DTNB method, the intracellular MDA levels were detected by TBA.Results The CCL2, CCL10, MDA and GSH levels in the model group were all higher than those in the normal group, and the SOD level was lower than that in the normal group (allP<0.05). The levels of CCL2, CCL10, GSH, and MDA in the supernatant of salvianolic acid B group, salvianolic acid A group and salvianolic acid A+B group were all lower than those of the model group, and the SOD level was higher than that of the model group (allP<0.05). The levels of CCL2, CCL10, MDA and GSH at each time point in the supernatant of salvianolic acid A+B group were lower than those of the salvianolic acid A group and salvianolic acid B group. The levels of SOD were higher than those of the salvianolic acid A and salvianolic acid B group (allP<0.05). Conclusion The compatibility of salvianolic acid A and B can inhibit the expression of inflammatory chemokines CCL2 and CXCL10 in HK-2 cells, the effect of anti-inflammation and anti-oxidation is better than that of single component application, and the combination of the two components has synergistic protective effect on renal fibrosis.

renal tubular epithelial cells; renal fibrosis; salvianolic acid; monocyte chemoattractant protein; inflammatory chemokine; superoxide dismutase; malondialdehyde

国家自然科学基金资助项目(81260603)。

李均(1969-)，男，博士，教授，主要研究方向为中医药防治慢性肾脏病。E-mail: lijun69-1214@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.46.002

R285.5

A

1002-266X(2016)46-0007-04

2016-07-26)