过表达eNOS的MSCs对高血流性肺动脉高压大鼠的治疗作用

赵科研 郭晓东 李红岩 佟昌慈 张玉彪 王辉山 侯明晓

基础研究

过表达eNOS的MSCs对高血流性肺动脉高压大鼠的治疗作用

赵科研 郭晓东 李红岩 佟昌慈 张玉彪 王辉山 侯明晓

目的 观察过表达eNOS的骨髓间充质干细胞移植对高血流性肺动脉高压的作用。方法 构建过表达eNOS基因骨髓间充质干细胞。成年雄性Wistar大鼠，采用左侧颈总动脉与颈外静脉吻合法建立模型36只，分3组，即Shunt组、MSCs组和MSCs+eNOS组，每组12只；正常大鼠12只为Control组。由中心静脉注入细胞，2周后测定血流动力学指标、心肌质量变化及肺组织切片的病理变化，western blot及荧光定量PCR测定肺组织表达eNOS的变化。结果 细胞移植2周后肺组织中有eNOS表达；转染eNOS组表达eNOS mRNA和蛋白明显增加。MSCs组右心室收缩压较分流组下降［（31.9±2.4）mm Hg比（35.6±3.9）mm Hg］，MSCs+eNOS组下降更明显［（28.2±2.8）mm Hg比（35.6±3.9）mm Hg］（P＜0.05）。右心室肥厚指数分流组下降0.3411±0.0314，MSCs组下降0.3095±0.0231，两者相比差异有统计学意义；MSCs+eNOS组下降 0.2868± 0.0167，与MSCs组相比未见统计学差异。MSCs组肺组织病理改变减轻，肺小动脉中层变薄，而MSCs+eNOS组最明显。结论 MSCs可定植于肺组织并表达eNOS；MSCs移植对高血流量的肺动脉高压发挥治疗作用，联合转染eNOS进一步增加治疗效果。

分流性； 动物模型； 肺动脉高压； 内皮型一氧化氮合成酶

内皮型一氧化氮合成酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）最早从血管内皮细胞中被发现和纯化，故称为内皮型NOS。由eNOS催化生成的NO主要发挥以下作用：舒张血管平滑肌细胞抑制血小板聚集和吸附、细胞保护作用、抑制SMC增殖、促进SMC凋亡等。Giaid等[1,2]证实，原发或继发肺动脉高压（pulmonary artery hypertension，PAH）患者肺动脉中层肥厚和内膜纤维化的内皮NOS表达明显减少。Celemejer等[3]证实，发生PH前合并流量增加婴儿和儿童，早期选择性内皮依赖的肺血管松弛的损害，提示早期NO的生物利用下降，因此我们考虑转染eNOS基因治疗PAH。骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）具有高度可塑性，易于体外扩增，因其来源充足、取材方便，体外增殖能力相对较强，而且在异体移植中排斥反应小，被认为是组织工程和基因工程的理想种子细胞。采用MSC作为种子细胞转染eNOS基因，使细胞高度表达eNOS，移植肺动脉高压大鼠，从细胞和基因两个角度治疗肺动脉高压，可能会起到更好的治疗效果。

本研究通过大鼠颈总动脉与颈外静脉吻合建立高肺血流量的肺动脉高压模型，骨髓间充质干细胞转染eNOS，探讨体内移植对分流性肺动脉高压大鼠的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物及实验环境 成年雄性 Sprague Dawley（SD）大鼠48只，体重150～200 g，周龄6周，购自沈阳军区总医院实验动物中心［SCXK（辽）2010-0001］，于沈阳军区总医院动物实验中心饲养，使用合格证号［SYXK（军）2012-0003］，饲料及水由动物实验中心提供，确保不含干扰本实验结果的成分。

1.2 主要药品试剂与仪器 NOS-3（eNOS）抗体（美国Santa公司），RT-PCR试剂盒（大连宝生物Takara公司），DNA扩增仪（PT-200型，美国PE公司产品），荧光定量PCR扩增仪（美国Applied Biosystems公司GeneAmp730）。

1.3 方法

1.3.1 细胞准备 过表达eNOS慢病毒载体（上海吉凯公司），基因信息：人类NOS3（NM_000603），即eNOS；GV358载体含有GFP标记。慢病毒转染eNOS到SD大鼠骨髓间充质干细胞（Cyagen公司）：细胞复苏、培养后，接种5×105个MSCs于6孔板中的2个孔，体积2 ml。使用ENi.S.稀释病毒，滴度为1×108TU/ml。细胞更换培养液加入200 μl Polybrene（M）和200 μl稀释后的病毒，感染时培养基终体积1 ml。混合后继续培养，12 h后更换新鲜培养基。感染3 d后，观察荧光表达情况细胞生长情况，如慢病毒感染成功细胞状态良好，进行传代培养。第三代MSCs，以0.25%含EDTA的胰酶消化，PBS冲洗，1000个细胞/μl浓度以PBS悬浮，置于冰上直到进行移植。

1.3.2 实验动物分组及细胞移植 采用左侧颈总动脉与左颈外静脉吻合分流[4]建立高血流性肺动脉高压模型。12周后大鼠再次麻醉、固定，沿原颈部正中纵切口切开，检查原吻合口通畅的进行分组。36只通畅的进行以下实验分组，采用成组设计：Shunt组、MSCs组和MSCs+eNOS组，每组12只；同一批正常大鼠12只为Control组。通过游离的右侧颈外静脉进行移植。Shunt组：注射1 ml磷酸盐缓冲液（phosphate balanced solution，PBS）；MSCs组：注射1 ml 1×106个MSCs；MSCs+eNOS组：注射1 ml含有1×106个转染eNOS基因的MSCs；Control组：注射1 ml PBS。采用4-0涤纶线连续缝合颈部切口，待大鼠自然清醒后常规饲养。检查及取材：2周后再次全身麻醉，进行各项检查及取材。

1.3.3 MSCs肺组织定位 细胞移植2周后，处死MSCs+eNOS组大鼠时，取右肺上叶组织，在暗光下操作，采用OCT包埋，冰冻切片，厚2～3 μm，采用多聚甲醛固定，PBS冲洗3次，每次5 min，无菌的DAPI 50 mg/L复染组织细胞核5 min，PBS再次冲洗，甘油封片，避免气泡产生，快速在荧光显微镜下观察、照相观察GFP表达。

1.3.4 血流动力学指标 右心微导管测右心室收缩压（RVSP），压力波形经BL-420E系统记录并保存。

1.3.5 病理学检查 取大鼠的肺组织，置于10%中性甲醛液中固定，经常规乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片，经HE染色，光镜显微镜观察肺组织。分离心脏组织，测定右心室/（左心室+室间隔）质量比。

1.3.6 Western blot检测 提取肺组织蛋白：将冻存的肺组织取出后融化，加入适量含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液，利用组织匀浆器制备成组织匀浆；4℃，12 000 rpm离心20 min，取组织总蛋白上清液转移至另一新的EP管中，置于-20℃保存备用。

免疫印迹杂交（Western blot）：蛋白样品加入相应比例的SDS凝胶上样缓冲液，变性5 min，电泳，电泳浓缩胶电压90 V，分离胶110 V，待溴酚蓝电泳至凝胶的底部时停止电泳，转膜过夜，室温封闭1 h，缓慢摇晃。加入特异性一抗4℃杂交过夜，次日用1×TBST洗膜3次（10 min/次），然后用1∶5000稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗，室温缓慢摇晃杂交2 h。1×TBST洗膜3次（10 min/次）。一抗如下：GAPDH（Santa）和eNOS（Santa）。ECL（Bio-rad）发光，Western blot成像系统采集图像。

1.4 统计学方法 使用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析。数据采用±s表示，进行两样本均数的t检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 骨髓间充质干细胞eNOS的表达

2.1.1 MSCs形态学检测结果 细胞均呈长梭形生长，极性较好，立体感一般，生长速度较快，经传代5次后，细胞仍很有活力，以1∶3～1∶4的比例传代，约48 h即可长满。细胞从第5代开始生长速度变慢，细胞形态未见改变。细胞转染携带慢病毒后，可见细胞呈细胞浆绿色表达。见图1。

2.1.2 MSCs在大鼠体内示踪 转染GFP的MSCs颈外静脉移植分流大鼠2周后，肺、心、肝和肾等重要组织冰冻切片，采用荧光显微镜观察，未见心、肝和肾脏GFP表达，而肺脏中可见明显绿色荧光表达，参入到肺组织中，说明MSCs可在肺组织存活达2周并表达转染基因。见图2。

2.1.3 各组肺组织eNOS的表达 采用Western blot检测大鼠肺组织中eNOS蛋白水平，Shunt组较Control组表达量降低，MSCs组与Shunt组相比有所增加，MSCs+eNOS组eNOS表达明显增加，说明转染eNOS基因的MSCs移植2周后在大鼠肺组织中存活，而且有较高水平eNOS蛋白表达。见图3。

2.2 肺组织病理变化 光镜下可见Shunt组大鼠的终末细支气管旁肌性小肺动脉中膜增厚、管腔狭窄，肺泡间质增生、炎症细胞增多；而MSCs组和MSCs+eNOS组肺小动脉中膜增厚程度明显减轻，且差异有统计学意义（P＜0.05）；正常对照组肺动脉管壁菲薄，内皮细胞扁平连续，细胞分布均匀，大小厚薄较一致。

2.3 右心室收缩压、心室体重比及右心室肥厚指数改变 细胞移植2周后，与Shunt组相比，MSCs组和MSCs+eNOS组的RVSP明显下降，分别从（35.6±3.9）mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）下降至（31.9±2.4）mm Hg和（28.2±2.8）mm Hg（P＜0.05）。说明MSCs移植能明显减轻高血流性肺动脉高压压力，且MSCs+eNOS组和MSCs组之间差异显著，转染eNOS的MSCs能进一步降低RVSP。细胞移植2周后心室体重比及右心室肥厚指数MSCs组和MSCs+eNOS组较分流组明显下降，转染eNOS基因未进一步减轻双心室的肥大。见图4。

3 讨论

肺动脉高压是顽固性和致死性疾病，其主要特征是肺动脉压力和肺血管阻力进行性升高，最终导致患者右心衰竭而死亡[5,6]。高流量诱导的肺高压患者具有明显的围手术期死亡率和术后较低的长期存活率[7]。干细胞移植治疗的再生手段和基因治疗等研究不断应用于PAH的治疗，以打断PAH的恶性循环。

移植细胞的标记是研究其在体内定位的常用方法。本实验观察到携带GFP蛋白MSCs移植2周后显示较强的发光，MSCs定植于肺泡或肺血管发挥作用。而在其他脏器如心、肝、肾脏均未见GFP荧光。这与Campbell等[8]的研究相似。因此认为肺是天生的解剖滤器，由中心静脉注射的悬浮细胞到达肺动脉后难以通过肺微血管到达肺静脉，从而汇到左心房、左心室而到达全身脏器，采用这种方法细胞以高度选择方式到阻力前毛细血管床可以证明对治疗某一肺动脉血管疾病非常有用。

关于基因转染联合干细胞治疗尝试治疗慢性分流性肺动脉高压报道很少[9,10]。本实验发现，大鼠在左侧颈总动脉与颈外静脉吻合后12周高血流明显增加了RVSP，肺血管改变大多为可逆性病变，MSCs单纯移植及联合eNOS转染MSCs移植该模型2周后均能够降低RVSP，改善肺组织小动脉内膜及中层厚度，增殖减缓，抑制了肺动脉高压的进展，具有明显的肺组织重构作用，转染eNOS基因治疗效果更明显。分流组心室重量体重比和右心肥厚指数增加明显，MSCs移植后两指标明显下降，说明MSCs移植能明显减轻高肺血流的心脏肥大。统计学显示转染eNOS基因较单纯MSCs未见进一步减轻心室的肥大和右心室肥厚，可能肺小动脉的改变可很快降低肺动脉后负荷，但还未来得及出现显著的右心室肥厚减轻，或许需要更长的时间才能表现出来或需要增加样本量才有意义。

（本文图片见后插四）

［1］Giaid A，Saleh D.Reduced expression of endothelial nitric oxide synthase in the lungs of patients with pulmonary hypertension.N Engl J Med，1995，333：214-221.

［2］Giaid A.Nitric oxide and endothelin-1 in pulmonary hypertension.Chest，1998，114：S208-212.

［3］Celermajer DS，Cullen S，Deanfield JE.Impairment of endothelium-dependent pulmonary artery relaxation in children with congenital heart disease and abnormal pulmonary hemodynamics. Circulation，1993，87：440-446.

［4］Zhao KY，Li HY，Wang HS，et al.Establishment and pathophysiological changes of a rat model of increased blood flow-induced pulmonary arterial hypertension by anastomosis of the left common carotid artery to left external jugular vein.Chin J Comp Med，2015，25：33-38.

［5］Rubin LJ.Pathology and pathophysiology of primary pulmonary hypertension.Am J Cardiol，1995，75：51A.

［6］温林芳，习昕，刘双.生物标志物与肺动脉高压病情及预后关系的研究进展.中国医药，2016，11：924-928.

［7］Mathew R，Gewitz MH.Pulmonary hypertension in infancy and childhood.Heart Dis，2000，2：362.

［8］Campbell AIM，Kuliszewski MA，Stewart DJ.Cell-Based Gene Transfer to the Pulmonary Vasculature Endothelial Nitric Oxide Synthase Overexpression Inhibits Monocrotaline-Induced Pulmonary Hypertension.Am J Respir Cell Mol Biol，1999，21：567-575.

［9］Zhao Q，Liu Z，Wang Z，et al.Effect of Prepro-Calcitonin Gene-Related Peptide-Expressing Endothelial Progenitor Cells on Pulmonary Hypertension.Ann Thorac Surg，2007，84：544-552.

［10］Liu R，Wu S，Cao G，et al.Transfection of human hepatocyte growth factor gene inhibits advancing pulmonary arterial hypertension induced by shuntflow in a rabbitmodel. Transplant Proc，2013，45：705-712.

Effects of implantation of mesenchymal stem cells over-expressing endothelial nitric oxide synthase on pulmonary arterial hypertension of high blood flow in rat models

ZHAO Ke-yan＊，GUO Xiao-dong，LI Hong-yan，et al.＊Department of Cardiovascular Surgery，General Hospital of Shenyang Military District，Shenyang 110840，China Corresponding author：HOU Ming-xiao，E-mail：houmx188@163.com

Objective To observe effects of MSCs over-expressing eNOS on PAH rats of high flow blood.MethodsLentivirus expressing eNOS gene were constructed and transfected to MSCs to be transplanted.Adult male Sprague Dawley rats，with anastomosis of the left common carotid artery and left external jugular vein，were randomly divided into three groups:group shunt，group MSCs and group MSCs+eNOS（n=12，respectively）.The control group was matched normal rat.MSCs or equal volume PBS were injected through right external jugular vein. Two weeks later，hemodynamic index，pathological changes of myocardial tissue and lung biopsy were determined. Fluorescence quantitative PCR（FQ-PCR）and Westernblot were used to determine the level of mRNA and protein of eNOS were determined.ResultsENOS can be detected in rat lungs after cell transplantation.And there were high eNOS protein expression in group MSCs+eNOS，but poor in the other three groups.The RVSP decreased from（35.6±3.9）mm Hg in the group shunt to（31.9±2.4）mm Hg in the group MSCs and to（28.2±2.8）mm Hg（P＜0.05）in the group MSCs+eNOS（P＜0.05）.Right ventricular hypertrophy index significantly reduced from 0.3411± 0.0314 in the group shunt to 0.3095±0.0231 in the group MSCs and to 0.2868±0.0167 in the group MSCs+eNOS（P＜0.05 respectively），but there was no statistical significance between the latter groups.RVSP and lung′s lesions were attenuated and pulmonary medium wall was thinner in group MSCs，while these were thinnest in group MSCs+eNOS.ConclusionMSCs can locate in rat lungs and express eNOS after cell transplantation.MSCs transplantation has therapeutic effects on PAH of high blood flow and ransfected eNOS can further improve the effects.

Shunt； Animal model； Pulmonary artery hypertension； eNOS

10.3969/j.issn.1672－5301.2017.07.023

Q95-33；R544.1+6

A

1672-5301（2017）07-0667-04

2017-02-15）

辽宁省自然科学基金（项目编号：2015010421-301）

110840 辽宁省沈阳市，沈阳军区总医院心血管外科（赵科研、郭晓东、李红岩、王辉山），全军重战创伤中心实验室（佟昌慈、张玉彪、侯明晓）

侯明晓，E-mail：houmx188@163.com