大庆湿地水体中可培养蓝藻的分布及其形态鉴定

解凌楠，王鑫雷，王丽艳，金雷，张文劲，荆瑞勇，刘永春

（黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院，大庆 163319）

大庆湿地水体中可培养蓝藻的分布及其形态鉴定

解凌楠，王鑫雷，王丽艳，金雷，张文劲，荆瑞勇，刘永春

（黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院，大庆 163319）

通过限制性培养技术富集大庆湿地水样中的可培养蓝藻，采用显微镜观察法对可培养蓝藻进行观察及鉴定。结果表明，大庆湿地可培养蓝藻含单细胞蓝藻和丝状蓝藻，在不同类型湿地中不同时期的水样中可培养蓝藻的类群是不同的。经显微镜观察初步鉴定，大庆湿地水体中可培养蓝藻菌株主要分布在4个目，即色球藻目（Chroococcales）、胶须藻目（Rivulariales）、颤藻目（Oscillatoriales）和念珠藻目（Nostocales），8个属，即聚球藻属（Synechococcus）、集胞藻属（Synechocystis）、眉藻属（Calothrix），鞘丝藻属（Lyngbya）、束藻属（Symploca）、微鞘藻属（Microcoleus）、席藻属（Phormidium）和鱼腥藻属（Anabaena）和1个类群，即蓝绿藻类群（Gloeocapsa group）。

可培养蓝藻；富集；显微观察；大庆湿地；分布

蓝藻，亦称蓝细菌，是一类光能自养型细菌，在生物圈中广泛存在。蓝藻被广泛应用于固氮生物肥的研制[1]、环境污染的修复[2]、功能菌株的开发[3]、共生固氮机制的探索[4-5]及保健食品的研发等方面，蓝藻也存在有害的一面，大量蓝藻的爆发可引起海洋赤潮、湖泊水华现象，引起环境二次污染。因此，调查环境中蓝藻的分布情况具有重要意义[6-8]。环境中蓝藻的分布调查主要采用两种方法，其一形态观察法；其二为分子生物学方法。形态观察法是常用的一种鉴定方法，可对不同环境中蓝藻种类的分布特征进行描述[6-11]；分子生物学方法可相对精确地估计环境中蓝藻的种类。

大庆湿地位于我国松嫩平原中部，位置为123° 45′～125°47′E，45°23′～47°28′N。湿地面积达60万公顷，湿地类型多样，鱼类、植物、浮游生物多样、丰富[12]。大庆湿地作为我国内陆碱性湿地，水体中蓝藻的分布情况鲜有报道。蓝藻分离纯化方法较费时[6-7]，分子生物学方法相对投入较大[10]。因此，研究采用液体连续富集大庆湿地蓝藻菌株，采用显微镜观察法[9]，初步估计大庆湿地可培养蓝藻的分布特征，为开发新的菌种资源提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试水体于2014年5月1日或2日、6月12日分别采集于大庆湿地水样，包括万宝湖（N46°35′，E125°05′）、扎龙湿地（N47°18′，E124°25′）、扎龙芦苇塘（N47°18′，E124°26′）、龙凤湿地（N46°32′，E125° 11′）、林甸稻田（N47°18′，E124°37′）（6月20日取样）、黎明湖（N46°35′，E125°07′）等地。采样时取水表下层5 cm处水体（稻田水样采集于表面），采用7点采样混合法，用塑料瓶进行收集后置于放冰袋的采样箱中，于6 h内送至实验室，4℃冰箱保藏。

1.2 试验设计

将2014年不同时期采集的水样5 mL，接种于装有45 mL已灭菌的选择性BG-11[11]（放线菌酮100 mg·mL-1）液体培养基的250 mL三角瓶中，于25℃，2 000 lx的光照强度下静置培养。将大庆湿地不同水样中富集的蓝藻连续传代4～5次，以富集可培养蓝藻类群，逐步淘汰环境中不可培养的蓝藻类群。每传一代接种三瓶，以上一代三瓶培养物的混合物为接种物，接种量均为10%（v/v）。当不同水样中蓝藻传至第5代时，将每一水样经富集的培养混合物取5次进行显微镜观察，去同存异。

1.3 观察和鉴定

取每样点富集后培养物混合物10 μL于载玻片上，用枪头均匀分散可培养蓝藻菌丝，盖上盖玻片，用Olympus显微镜40倍物镜或100倍油镜进行观察，以测微尺测定细胞大小。根据蓝藻的个体形态、群体形态、培养特征、细胞大小等特征对照藻类分类图谱进行分类鉴定，以《中国淡水藻志》第九卷蓝藻门[10]及Waterbury的《蓝藻分离纯化鉴定》[11]为主要参考依据。

2 结果与分析

2.1 大庆湿地水体中可培养蓝藻的分布及群落的描述

大庆湿地类型多样，包括天然湿地和人工湿地两种类型，研究共采样为6个采样地点，包括天然湿地的扎龙芦苇塘（ZLT），扎龙湿地（ZLW）、和龙凤湿地（LFW），人工湿地的万宝湖（LWB）和黎明湖（LLM）及林甸稻田（LDP）。通过选择性BG-11液体培养基富集可培养蓝藻类群5代后显微镜观察发现，大庆湿地水体中以丝状蓝藻为主，也存在着球状蓝藻。

图1可见，在供试样品中，可培养的球状蓝藻主要分布扎龙湿地、万宝湖及扎龙芦苇塘水体中。根据形状、大小、有无异形胞及细胞分裂情况等形态特征，参考Waterbury的《蓝藻分离纯化与鉴定》，ZLW、LWB和ZLT供试样品中分布的可培养单细胞蓝藻初步鉴定分别归属于蓝绿藻类群（Gloeocapsa group）、聚球藻（Synechococcus）和集胞藻属（Synechocystis）（见表1）。

对丝状蓝藻主要参考朱浩然的《中国淡水藻志》第九卷蓝藻门进行初步鉴定[10]，其形态学特征见图1、表1，可培养丝状蓝藻归属于3个目，即胶须藻目（Rivulariales）、颤藻目（Oscillatoriales）和念珠藻目（Nostocales），6个属，即眉藻属（Calothrix），鞘丝藻属（Lyngbya）、束藻属（Symploca）、微鞘藻属（Microcoleus）、席藻属（Phormidium）和鱼腥藻属（Anabaena）。

从显微观察结果发现，在人工湿地中发现单细胞蓝藻聚球藻属（Synechococcus）类群，丝状蓝藻眉藻属（Calothrix）、鞘丝藻属（Lyngbya）类群，而天然湿地中也发现单细胞蓝藻集胞藻（Synechocystis）类群、蓝绿藻类群（Gloeocapsa group），丝状蓝藻鞘丝藻属（Lyngbya）、束藻属（Symploca）、微鞘藻属（Microcoleus）、席藻属（Phormidium）和鱼腥藻属（Anabaena）类群，天然湿地和人工湿地中可培养蓝藻类群的分布未发现明显规律。

2.2 大庆湿地水体中可培养蓝藻的群落变化规律

研究对大庆湿地除黎明湖和林甸稻田外的其余4个样点两个时期蓝藻类群均进行了成功地富集培养。由表1可见，万宝湖、扎龙芦苇塘、扎龙湿地及龙凤湿地水体中在两次采样期间（40 d）可培养蓝藻有不同程度的群落演替。万宝湖水体中由聚球藻（Synechococcus）为主导的可培养蓝藻逐渐演替为鞘丝藻属（Lyngbya）为主导的蓝藻类群；扎龙塘水体中存在着大量球状可培养集胞藻（Synechocystis）逐渐演替为束藻属（Symploca）和微鞘藻属（Microcoleus）的可培养蓝藻类群。随着外界环境的变化蓝藻类群会发生群落演替。

图1 大庆湿地不同水样中可培养蓝藻的形态显微照片Fig.1 Morphological micrograph of cultivable cyanobacteria from different water samples in Daqing wetland

表1 大庆湿地不同水样中部分可培养蓝藻形态指标测定Table 1 Morphological index detection of cyanobacteria in different water samples of Daqing wetland

3 结论与讨论

蓝藻菌种的分离鉴定方法及多样性调查有显微观察法及分子生物学方法[10,13]。蓝藻采用显微镜法检测时仅对形态学特征及生理特征进行描述[11]，相对于分子生物学方法相对直观，而分子生物学方法基本上基于蓝藻的DNA进行监测[13-14]，各具特点。蓝藻的分离纯化工作相对费时[5-7]，采用富集显微观察又可直观地观察蓝藻的形态特征。通过富集大庆湿地水样中可培养蓝藻类群，采用显微形态观察发现大庆湿地水体中存在着单细胞蓝藻和丝状蓝藻，这是首次采用显微镜观察并初步鉴定了大庆湿地蓝藻类群的特点，同时发现在不同水样中存在着不同的类群，且在同一地点水样不同时期蓝藻的主要类群不同，为可培养蓝藻形态学鉴定提供数据支持。

单细胞蓝藻广泛存在于环境中，据报道海洋中蓝藻主要以单细胞蓝藻为主，如原绿球藻（Prochlorococcus）和聚球藻（Synechococcus）[15]。而在淡水水体中主要以丝状蓝藻为主，尤其在稻田中主要以丝状蓝藻为主[13]。在观察蓝藻形态特征时，发现按以前的报道蓝藻的菌丝宽度均较大，约为5～9 μm，但采用油镜观察所测定的菌丝的宽度均较小，可能在大庆湿地存在着新的蓝藻类群。此外，在蓝藻鉴定时，应采用分离培养技术结合分子生物学技术更加准确地描述蓝藻归属。目前为止，关于蓝藻的形态学鉴定相关资料相对较少，为拓展蓝藻的形态学鉴定方法提供数据支持。

综上所述，研究从大庆湿地6个样点两个时期采集水样，采用BG-11选择性培养基富集可培养蓝藻类群，通过显微镜观察方法，首次发现大庆湿地存在着单细胞蓝藻，初步鉴定为色球藻目（Chroococcales）的聚球藻（Synechococcus）、集胞藻（Synechocystis）及蓝绿藻类群（Gloeocapsa group）。供试大庆湿地水体中主要以丝状蓝藻为主，分布在胶须藻目（Rivulariales）的眉藻属（Calothrix）、颤藻目（Oscillatoriales）的鞘丝藻属（Lyngbya）、束藻属（Symploca）、微鞘藻属（Microcoleus）和席藻属（Phormidium）以及念珠藻目的鱼腥藻属（Anabaena）。供试大庆湿地水样中不同时期，蓝藻的类群将发生群落演替。通过显微镜观察可直观清晰地了解大庆湿地不同样点在不同时期蓝藻类群的变化，为蓝藻的鉴定及菌种资源的开发提供基础数据。

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Distribution and Identification of Cultivable Cyanobacteria from Water Sample in Daqing Wetland

Xie Lingnan，Wang Xinlei，Wang Liyan，Jin Lei，Zhang Wenjin，Jing Ruiyong，Liu Yongchun
（College of life Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319）

Cultivable Cyanobacteria was enriched by limited-culture technology，the cultivable cyanobacteria in Daqing wetland was observed and identified by microscope.The results showed that there were unicellular and filamentous cultivable cyanobacteria in Daqing wetland，cultivable cyanobacterial species were different in different type wetlands at different sample stages.By the identification of microscopic observation，the observed cyanobacteria were distributed into 4 orders of chroococcales，Rivulariales，Oscillatoriales and Nostocales，8 genus of Synechococcus，Synechocystis，Calothrix，Lyngbya，Symploca，Microcoleus，Phormidium，Anabaena and Gloeocapsa group.

Cynaobacteria；enrichment；microscopic observation；Daqing wetland；distribution

10.3969/j.issn.1002-2090.2016.05.015

Q938.2

A

1002-2090（2016）05-0077-04

2015-12-18

大学生创新项目（xc2014061，201410223024）；校博士启动基金（XDB2014-13）；国家自然科学基金项目（31300425）。

解凌楠（1994-），女，黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院制药工程专业2012级本科生。

王丽艳，女，副教授，硕士研究生导师，E-mail：laosan1@126.com。