甜菜蛋白质组学研究进展

张辉，白晨，王华忠，张惠忠，李晓东，付增娟，赵尚敏，鄂圆圆，张自强，王良

（1.中国农业科学院，北京100081；2.内蒙古农牧业科学院，呼和浩特010031；3.中国农业科学院甜菜所，哈尔滨150080）

甜菜蛋白质组学研究进展

张辉1，2，白晨2*，王华忠3*，张惠忠2，李晓东2，付增娟2，赵尚敏2，鄂圆圆2，张自强2，王良2

（1.中国农业科学院，北京100081；2.内蒙古农牧业科学院，呼和浩特010031；3.中国农业科学院甜菜所，哈尔滨150080）

概述了蛋白质组学的概念及研究方法，介绍了近年来甜菜不同领域蛋白质组学的研究应用进展，同时对蛋白质组学的发展前景进行了展望。

甜菜；蛋白组学；分子育种

甜菜是糖料作物之一，也可作为能源物质，可以生产氢气和乙醇[1]。甜菜是二年生常异花授粉作物，育种周期较长，而且甜菜的综合性状比较复杂，因此育种程序繁琐，较长时间才能育出符合要求的品种。目前分子辅助育种已经成为育种工作中必不可少的手段。在甜菜上也开展了很多分子辅助育种相关工作。蛋白质组（Proteome）是指一个基因组，或一个细胞、组织中转录翻译表达的所有蛋白质[2]。蛋白质组的研究内容是所有的蛋白质，而这些蛋白质是随着组织、器官甚至环境的变化而改变。蛋白质组学可以用来比较不同环境条件下的蛋白质组的变化[3-5]。一个蛋白质组并不对等着一个基因组的直接产物，因为蛋白质是在基因表达、转录、翻译合成后还包括蛋白质修饰等过程。因此，蛋白质组中所转录翻译表达的蛋白质数目是可以超过基因组大小的数目的。蛋白质组学研究内容目标在于阐明生物体全部蛋白质的表达及功能模式，研究内容包括蛋白质表达的鉴定、修饰形式、结构差异、功能变化和蛋白间的相互作用等[6-7]。目前，蛋白质组学研究已经从早期的利用双向电泳和凝胶蛋白鉴定蛋白质扩展到开发研究蛋白质的各个方面，如蛋白质相互作用、翻译后修饰、蛋白质结构和蛋白质胞内移位等，现在可以把蛋白质组学研究看作是大规模研究蛋白质各种相关问题的学科。国内科研人员在甜菜分子水平的研究工作有所进展，国内外对甜菜蛋白组学也有相关的报道，本文概述了蛋白组学的研究方法及近年来甜菜蛋白组学相关的研究进展情况，为相关研究提供参考。

1 蛋白组学研究相关技术

1.1 样品制备

一般培养的动物组织细胞由于没有细胞壁，所以可以将细胞收集下来，直接加入样品裂解液提取总蛋白质。从动物或植物组织里提取总蛋白质，没有一种通用的程序，但一般的提取原则基本是相同的。植物叶片总蛋白的提取方法一般是三氯乙酸-丙酮沉淀法和超速离心法。蛋白质定量目前所使用的分光光度法是依靠考马斯亮蓝结合或蛋白质催化的二价铜离子被还原成一价铜离子的反应。目前有双向电泳蛋白定量试剂盒用于较精确的测定蛋白质浓度，并且可以在定量蛋白质的同时，将一些干扰物质去除。

1.2 蛋白分离技术

目前用于蛋白质分离提取的主要方法一般有一维凝胶电泳（one-dimensional gel electrophoretic，1-DE）和高效液相色谱法、二维（双向）凝胶电泳（two-dimensional gel electrophoretic，2-DE）等。一维凝胶电泳是按蛋白质的大小将蛋白质分离开。该方法成本较低，但是分离上存在很多限制，例如：对于疏水性与膜蛋白之溶解度限制大、对于碱性或酸性蛋白质难以有效分离、低的敏感度与难以定量、无法自动操作等。高效液相色谱法也被广泛地用于蛋白质的分离和检测，其具有分析速度快、灵敏度高、方法灵活等优点。双向电泳由O’Farrel在1975年首次建立，是一种分析细胞、组织或其他生物样本中提取的蛋白混合物的有效方法，已经得到了广泛的应用[8]。双向电泳技术可以同时分离数千种蛋白质，并且也可以检测基因表达翻译后以及翻译过程中的蛋白质修饰，这些修饰的变化过程是没有办法通过基因组序列分析预测的。蛋白质双向电泳技术已经应用在诸多领域，如蛋白组分析、新药开发、纯度检测、细胞鉴定及微量蛋白纯化等领域。

1.3 胶上蛋白质检测方法

凝胶上的蛋白质检测常用的方法有考马斯亮蓝染色、银染、负染、荧光标记、同位素标记等。其中银染是非放射性染色方法中灵敏度最好的，其灵敏度可达200pg。负染是一种可逆染色方法，有铜染、锌-咪唑等，其灵敏度可达50ng，高于考染低于银染，准备从胶上回收蛋白可选用此方法。荧光标记利用丙基Cy3和甲基Cy5两种染料分别对不同蛋白质样品进行荧光标记，并在一块2-D胶上同步运行，由于两种修饰后的染料激发波长的差异，在同一块胶上可以利用两个波长范围进行扫描，并可得到两个样品的差异，灵敏度比银染要高3～30倍。另一荧光染料是SYPRO Ruby，它是基于钌的金属螯和染料，灵敏度为0.25～1ng。同位素标记相对和绝对定量技术是近年来开发的一种新的蛋白质组学定量研究技术。结合非凝胶串联质谱技术，可对细胞器、细胞裂解液、复杂样本等进行相对和绝对定量研究，具有较好的定量效果和较高的重复性，并且可对4种不同样本同时进行定量分析。

1.4 质谱技术

质谱技术是近年来蛋白质组学研究最重要的技术之一，其基本原理是在样品分子离子化后，利用不同离子间的核质比（m/z）差异来分离并确定分子量。历史上第一台质谱仪是英国科学家弗朗西斯·阿斯顿于1919年制成的。目前常用的质谱技术有液质联用（LC-MS）、质谱/质谱串联（MALDI-TOF/TOF）、基质辅助激光解吸及电离飞行时间质谱分析法（MALDI-TOF-MS）和电喷雾离子化串联质谱分析法（ESIMS/MS）。MALDI-TOFMS质谱技术易于操作，有利于高通量蛋白质分析，该方法的分辨率和灵敏度比较高，较适于测定肽相对分子质量；而ESIMS/MS技术更适于测定肽序列。

1.5 鉴定技术

质谱技术最终测试所得结果是通过蛋白质数据库、高通量质谱分析软件以及生物学信息学的方法来对蛋白质进行鉴定的。进而获得蛋白质的一级及二级结构，从而获得蛋白质相关的信息。生物信息学是蛋白质组研究的重要支撑，一些生物信息学研究机构是利用收集整理的生物实验所产生的数据，建立不同类型的生物信息数据库，以供科研人员查询利用。目前，最常用的数据库为NCBI数据库，NCBI数据库是全世界范围最有影响的生物学网站之一，它是提供综合、混合数据库的蛋白质和核酸数据库。NCBI关于甜菜蛋白质的数据库中包括：蛋白质保守区域有2个，测序的蛋白质序列有39301条，实验测定的大生物分子的结构9个。其中测定的蛋白质序列中与抗性相关的蛋白序列有642条，其中丛根病抗性有关的蛋白序列63条，与育性相关的蛋白序列161条，与耐盐性相关的蛋白序列152条。并且NCBI可对全球分子数据库和文献进行检索、搜索和分析。蛋白质数据库（Swiss-Prot）也是一个比较常用的数据库，它目标在于提供高水平的注释（例如描述蛋白质的作用域结构、功能、突变体、翻译后修饰等），以及最低水平的冗余及其他数据库的整合。

2 甜菜蛋白质组学研究

2.1 甜菜育性相关蛋白质组学研究

杂种优势是生物界存在的一种普遍现象，因此在育种工作中利用杂种优势获得优异的品种、种质资源是育种工作者最常用的方法。目前一些重要的农作物如玉米、高粱、水稻、茄子、番茄、青椒、向日葵、油菜等在生产中都有杂种一代的利用。甜菜是重要的糖料作物，目前生产上使用的大部分品种也是杂交种。甜菜是无限花序作物，花器较小，去雄较困难。因此目前生产上都是利用雄性不育系来选育杂交品种。对甜菜雄性不育的机制研究也一直是科研工作者的重要研究内容之一。

王华忠对不育系及其保持系的花药、花粉、雌蕊的生物学特性及发育过程进行了比较分析。发现不育系花药和花粉的形态与细胞明显异常。通过间接酶联免疫（ELISA）检测技术，对营养生长期和生殖生长期的功能叶片和花蕾中4大类内源激素含量和比值进行了比较分析，发现保持系与不育系间也存在显著差异[9]。施真等以甜菜细胞质雄性不育系DY5-CMS及其保持系DY5-O为材料，通过PCR及直接测序等方法，对甜菜线粒体atp6基因转录本的RNA编辑位点进行了研究。发现atp6基因转录本的保守区域有8个编辑位点，通过分析可以发现atp6基因的RNA编辑有着改变蛋白质疏水性的作用，同时它能增加物种间的保守性[10]。此外，王有昭等针对国内55种主要品系甜菜的细胞质多样性利用VNTR和PCR-RFLP方法进行了研究，发现我国甜菜品系细胞质不育型过于单一化，几乎都属于Owen型不育系，我国选育的保持系的细胞质中一些材料混有恢复系细胞质，此研究为以后育种方面的品系选择提供了依据[11]。

曹洪祥利用蛋白质组学对M14和栽培品种进行了比较分析，发现在栽培甜菜中缺失而在甜菜M14中特异表达的蛋白质点18个，只在栽培甜菜中表达的蛋白质点5个，对96个差异表达的蛋白点进行质谱分析，鉴定到72个蛋白。这些蛋白质分别属于代谢、能量、蛋白质合成、胁迫和防御等相关蛋白[12]。牛佳等利用2-DE与MALDI-TOF-MS的技术对甜菜质核互作型雄性不育系DY5-CMS及同型保持系DY5-O花粉发育的不同阶段及花期叶片蛋白差异表达进行了研究，揭示了Owen型甜菜不育系材料与保持系材料叶片及花蕾不同发育时期的蛋白表达差异。研究发现了在雄蕊原基分化期花蕾中有6个与育性相关的差异蛋白，而在四分体时期，鉴定发现3个分别在三羧酸循环、细胞周期调控和过氧化氢酶的清除过程中起着非常重要作用的蛋白；单核时期的比较分析，找到7个与雄性不育有关的蛋白，其中有5个蛋白还与植物光合作用有关[13]。国外科研人员也对甜菜细胞质雄性不育和保持系进行了大量研究工作，Wesołowski等利用蛋白质组学的方法对细胞质雄性不育系和保持系的线粒体的差异蛋白进行了比较分析，发现育性的变化与ATPase有关[14]。

2.2 甜菜抗旱性相关蛋白质组学研究

甜菜干旱是限制甜菜产量的主要因素之一。分子辅助育种（MAS）候选基因的鉴定可以大大增加抗旱育种效率。干旱条件诱导的蛋白质组的变化可以推测出相关的重要基因。Hajheidari M等对两种不同遗传背景基因型的甜菜（7112和7219）进行田间栽培，在四叶期开始进行水分亏缺处理。在播种后157d，从浇水和干旱胁迫的材料中进行叶片样本收集，并进行植物蛋白提取、测量地上部生物量和叶片相对含水量。对叶片蛋白诱导的变化通过二维凝胶电泳进行了研究和定量分析，并使用图像分析软件分析。重复性检测和分析出500个蛋白点，其中79个蛋白点在干旱胁迫下表现出显著的变化。某些蛋白质在干旱条件下表现出基因型特定的上调或下调模式。20个蛋白点进行了液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析，其中11个蛋白质鉴定具有氧化应激，信号转导和分子伴侣活性[15]。Rajabi A等在2004年在充分灌溉与限制灌水条件下，选择了以前的甜菜蛋白质组学研究中报道的与抗旱性相关的两个候选基因：2-cysteine Peroxiredoxin（2-Cys Prx）和核苷二磷酸激酶（NDPK），采用半定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）的表达分析表明，在这个为期两年的实地研究中基因型的干旱反应与2-Cys Prx基因型表达水平的差异是一致的，在候选基因的转录本丰度存在基因型差异[16]。Yongxue Zhang等概述了组学研究（基因组、转录组、蛋白组）对甜菜抗逆育种的辅助作用，尤其指出结合单体附加系所发现的一些甜菜抗逆方面的新特性，以期为育种工作服务[17]。

2.3 甜菜抗盐性相关蛋白组研究

甜菜是二倍体作物，共有2n=18条染色体[18]，被归为耐盐作物的一种[19]。甜菜单体附加系是一个独特的品系。在不同盐胁迫条件下对甜菜单体附加系材料M14的抗盐性研究中，Li H等采用iTRAQ二维LC-MS/MS定量蛋白质组学分析技术其膜蛋白质组的变化，鉴定了274个蛋白质，主要是膜蛋白，其中50种蛋白质表现出差异蛋白质水平的变化，40种蛋白表达上调和10种蛋白表达下调；Yang L等也用定量蛋白质组学技术，采用双向电泳进行总蛋白质分离，在叶片中鉴定了代表67个特异蛋白的86个蛋白点，在块根中鉴定了代表22个特异蛋白的22个蛋白点，在叶片和根部分别鉴定出75和43个差异表达蛋白质。这些蛋白主要参与运输（17%）、代谢（16%）、蛋白质合成（15%）、光合作用（13%）、蛋白质折叠与降解（9%）、信号转导（6%）、胁迫与防御（6%）、能源（6%）和细胞结构（2%）等。结果表明，膜蛋白有助于M14的耐盐性[17，20-20]。Yu B等利用定量蛋白组学和磷酸化蛋白质组学的方法对单体附加系M14进行了研究，发现189个蛋白表现出显著的变化，在盐胁迫下的磷酸化水平发生变化，发现几个信号元件与盐胁迫有关，15个差异蛋白在转录水平参与信号转导过程[22]。Pi Z等通过钾缺乏的胁迫处理，对胁迫前后的糖用甜菜的蛋白质组学进行了研究分析，发现27个蛋白质发生明显的变化，在某些方面一些元素能够恢复由于缺钾对蛋白水平的损害，但不能代替钾作为一种必需的营养素[23]。

2.4 甜菜抗病性相关蛋白质组学研究

尽管植物细胞具有高度的可塑性，植物只有在非常具体的生物和非生物胁迫下发展增生，如当暴露于病原体如甜菜曲顶病毒（BCTV）。Katherine等的研究发现BCTV的C4蛋白是足以诱导增生改变拟南芥发育。这表明C4蛋白与拟南芥的蓬松状的蛋白激酶atsk21和23相互作用，是激素油菜素内酯（BR）信号负性调节子。他们利用酵母双杂交技术发现，C4蛋白与其他5个atsk家庭成员相互作用，类似由C4蛋白诱导增生。发现C4蛋白的ser49残基是C4功能的关键。结果表明，血浆膜相关交互选择，多atsks与C4相互作用促进其自身磷酸化和激活细胞周期调控[24]。丛根病是甜菜生产中的重要病害，能导致严重减产，丛根病抗性研究一直也是甜菜学科的重要研究内容。吴则东等概述了甜菜丛根病坏死黄脉病毒（BNYVV）基因组的结构以及不同RNA编码蛋白质的功能作用，RNA1编码的P237蛋白质、RNA2编码的6种蛋白质、导致甜菜根重严重减产的RNA3编码的P25蛋白质、RNA4编码的P31的功能作用，揭示部分地区特有的RNA5结构[25]。于嘉林等对内蒙地区BNYVV分离物的CP基因和54kDa通读区片段进行拼接，构建了BNYVV 75kDa通读蛋白基因。与野生型相比，这些基因只有4个核苷酸发生了改变，对应地两个氨基酸也发生了改变。将75kDa通读蛋白基因和54kDa片段分别克隆到温度诱导型原核表达载体pJW2上，构建了这两个基因的原核表达载体。结果，75kDa通读蛋白基因在E.coli BL21（DE3）中经温度（42℃）诱导后可特异地表达75kDa蛋白和两种小蛋白，其中54kDa片段只表达出37kDa的蛋白[26]。

2.5 甜菜种子活力相关蛋白质组学研究

Catusse J等利用比较蛋白组学对经水合和时效处理后不同生长活力的甜菜种子进行了分析，比较了不同种子样品的蛋白质表达情况。结果表明在初期有18个蛋白质表达量上调，但渐渐过程中表达量下调，后来又上调。这意味着这些蛋白质在老化过程中表达是可逆的。其中11个蛋白质在控制种子活力的初期和成熟期，蛋白点的量呈现增加和减少相反的反应。结果表明几种脂肪和淀粉的代谢途径、蛋白质合成和甲基化循环在种子活力中有着重要的作用。此外证实了乙醛酸异柠檬酸裂解酶、蛋白的合成、脱落酸信号通路可能对种子活力有很大影响[27]。

3 展望

生命体的表达过程就是一个从DNA到RNA再到蛋白质的过程。生命体最终的体现就是通过蛋白质来实现各项功能。蛋白质组学研究是反向研究生命体的表达，通过研究蛋白质的表现来推断基因上的差异，从而更准确地研究生命体的一些变化。近年来蛋白质组研究已被应用到各种生命科学领域，如细胞生物学、神经生物学等。对于一些生命表达现象如蛋白质结构变化、细胞的分化以及信号的传导等也有所涉及。在医疗方面蛋白组研究也是寻找疾病分子标记以及药物靶标重要的方法。植物蛋白质组学研究已经被广泛地应用在很多作物，如甘蓝、棉花、白菜、玉米、水稻、甜瓜等。在甜菜上也开展了各个方向的研究。甜菜已经于2014年完成了全基因组测序，基于转录数据和注释的序列同源性的基础上，共预测了27421个蛋白质编码基因[28]。从而能为后基因组学研究提供必要的基础，从更多方面揭示甜菜及各种作物在不同环境条件的各种反应，更有效地为科研工作提供理论依据和参考。近年来各种组学研究正广泛地开展着，蛋白质组学和代谢组学是新兴的后基因组时代组学技术[29]。蛋白质组学与其它学科研究的交叉也变得日益显著和重要。预期，蛋白质组学与其它组学研究如基因组学，转录组学等领域的交叉，以生物信息学为辅助学科，所呈现出的系统生物学（System Biology）研究模式，将成为未来生命科学令人激动的最新前沿研究。

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Research Progress of Proteomics in Sugar Beet

ZHANG Hui1,2,BAI Chen2*,WANG Hua-zhong3*,ZHANG Hui-zhong2,LI Xiao-dong2,FU Zeng-juan2,et al
(1.Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing 100081;2.Inner Mongolia Academy of Agricultural and Animal Husbandry Sciences,Hohhot 010031;3.Institute of Sugarbeet,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Harbin 150080)

This paper summarizes the concept and research methods of proteomics,also introduces situation of sugar beet proteomics study in recent years and the prospects of plant proteomics.

sugar beet;proteomics;molecular breeding

S566.3

B

1007－2624（2017）02－0058－05

10.13570/j.cnki.scc.2017.02.020

2016-11-08

内蒙古自治区自然科学基金（2016MS0374）。

张辉（1985-），男，河北沧州人，助理研究员，在读博士，研究方向：甜菜遗传育种。E-mail：zhanghui_lxx@163.com

白晨（1959-），男，研究员，硕士生导师，主要从事甜菜遗传育种及分子育种。E-mail：nmgnkybc@163.com

王华忠（1957-），男，研究员，博士生导师，主要从事甜菜遗传育种与种质资源创新。E-mail：wwhhzz0451@163.com