冠心止痛胶囊含药血清内皮保护作用与体内给药时效关系研究

梁瑞峰，宋献美，王守富，卢吉锋

(1.河南省中医药研究院，河南 郑州 450004；2.河南医学高等专科学校，河南 郑州 451191；3.河南省中医药研究院附属医院，河南 郑州 450004)



实 验 研 究

冠心止痛胶囊含药血清内皮保护作用与体内给药时效关系研究

梁瑞峰1，宋献美2，王守富3*，卢吉锋1

(1.河南省中医药研究院，河南 郑州 450004；2.河南医学高等专科学校，河南 郑州 451191；3.河南省中医药研究院附属医院，河南 郑州 450004)

目的：观察冠心止痛胶囊含药血清对过氧化氢(H2O2)损伤内皮细胞的保护作用与体内给药的时效关系。方法：建立体外培养的HUVECs细胞H2O2氧化损伤模型，以冠心止痛胶囊不同给药方案所制备的含药血清对氧化损伤内皮细胞存活率、乳酸脱氢酶活性、一氧化氮、内皮素-1、组织型纤溶酶原激活物、组织型纤溶酶原激活物抑制剂的含量为指标，评价不同方案制备的含药血清对内皮细胞的保护作用。结果：不同方案所制备冠心止痛胶囊含药血清对H2O2诱导的HUVECs损伤均具有保护作用，连续3 d、5 d、7 d给药组含药血清的药效明显强于单次给药，连续5 d、7 d组的含药血清作用强于3 d组，但连续5 d、7 d组含药血清药效无统计学差异。结论：冠心止痛胶囊含药血清的药效与给药时间存在一定时效关系，以2次/d连续5 d给药后所制备的含药血清药理效应最佳。

冠心止痛胶囊；含药血清；时效关系；过氧化氢

中药及中药复方成分复杂，直接用于体外药理实验的科学性较差，难以得到认可。血清药理学将中药或中药复方给动物灌胃后，采集动物血液并分离血清，以含药血清作为药物用于中药的体外研究，可以避免中药直接应用体外实验带来的各种弊端[1]。然而制备含药血清的给药时间并没有统一的标准，中药成分多样，不同成分的药代动力学相差甚远，因此确定给药多长时间才能取得最佳的含药血清是血清药理学的重要问题[2]。冠心止痛胶囊是河南省中医药研究院附属医院的院内制剂，临床疗效确切，实验表明其对血管内皮具有很好的保护作用[3-4]。本研究采用不同给药时间制备的冠心止痛胶囊含药血清干预H2O2诱导损伤的人脐静脉内皮细胞，以确定制备含药血清的最佳方案，为进一步研究冠心止痛胶囊的作用机制奠定基础。

1 材料

1.1 药品与试剂

冠心止痛胶囊，由瓜蒌、半夏、红花、赤芍、蒲黄、川芎、紫苏梗等组成，为河南省中医药研究院附属医院的院内制剂，批准文号：豫药制字Z20121056，批号20130301。临用时将胶囊内容物用蒸馏水配成0.3 g/ml混悬液备用。胎牛血清、1640培养基、胰蛋白酶(Hyclone公司)；噻唑蓝(MTT，Amresco公司)；H2O2(国药集团化学试剂有限公司)；乳酸脱氢酶(LDH)、一氧化氮(NO)试剂盒(南京建成生物公司)；内皮素-1(ET-1)、组织型纤溶酶原激活物(tPA)、纤溶酶原激活物抑制剂(PAI-1)试剂盒(武汉华美生物工程有限公司)。

1.2 动物和细胞株

SPF级SD大鼠40只，雄性，体质量180～220 g，购于河南省实验动物中心，许可证号SCXK(豫)2010-0002。人脐静脉内皮细胞株(HUVECs)(南京凯基生物科技发展有限公司)。

1.3 仪器

Synergy NEO型全功能酶标仪(Bio-Tek公司)；3164型细胞培养箱(Forma Scientific公司)；2K15型冷冻离心机(Sigma公司)；XSJ-D型倒置相差显微镜(重庆光学仪器厂)。

2 方法

2.1 含药血清的制备

SD大鼠常规喂养，随机分为空白对照组、单次给药组、3 d给药组、5 d给药组、7 d给药组，每组8只，给药组给予冠心止痛胶囊3.0 g/(kg·d)(等效剂量的5倍)，空白组给予相同体积的蒸馏水。单次给药组仅给药1次，其余给药组，每天给药2次。各组分别在末次给药后1 h，麻醉后腹主动脉取血，3 000 r/min离心10 min分离血清，56℃水浴灭活，0.22 μm过滤除菌，-80℃保存备用[5]。

2.2 细胞培养

用含10%胎牛血清的1640培养液于37℃，5%CO2条件下培养人脐静脉内皮细胞，待细胞至80%融合时，加入0.25%胰酶消化，显微镜下见细胞圆缩、间隙增大时，立即加入含10%胎牛血清的1640培养液终止消化，吹打，制成细胞悬液进行实验。

2.3 不同给药方案含药血清对HUVECs细胞存活率的影响

将HUVECs细胞以1×105个/ml接种于96孔板，分为6组：空白对照组(15%空白大鼠血清)、模型对照组(15%空白大鼠血清+200 μmol/L H2O2)和各实验组(分别含15%不同方案含药血清+200 μmol/L H2O2)，每组6个复孔[6]，另设6孔为阴性组(无细胞)，孵育培养20 h后，每孔加入5 g/L的MTT 20 μL，继续孵育4 h，小心吸弃培养液，然后每孔加入150 μL DMSO，避光震荡10 min，用酶标仪于570 nm处测定各孔的吸光度(A)并计算细胞存活率。

细胞存活率(%)=(实验组A-阴性组A)/(空白组A-阴性组A)×100%

2.4 不同血清对HUVECs分泌LDH、NO、ET-1、tPA、PAI-1的影响

HUVECs细胞以1×105个/ml接种于48孔板，分组同“2.4”，每组6个复孔，培养24 h后，收集上清液，采用微板法检测各组细胞上清液中LDH的活性和NO的含量，ELISA法检测各组上清液中ET-1、tPA、PAI-1的含量。

2.5 统计学处理

3 结果

3.1 不同给药方案含药血清对细胞存活率的影响

与空白对照组相比，H2O2损伤后HUVECs存活率显著降低；与模型组相比，各方案制备的含药血清均能提高HUVECs细胞的存活率(P<0.01)。连续3 d、5 d、7 d制备的含药血清与单次给药相比，HUVECs细胞存活率差异无统计学意义。结果见表1。

组别剂量(g/kg)A值细胞存活率(%)空白对照组-0.580±0.082**100.00模型对照组-0.297±0.04651.21单次给药组3.00.432±0.061**74.483d给药组3.00.421±0.058**72.595d给药组3.00.457±0.069**78.797d给药组3.00.451±0.057**77.76

注：与模型对照组比较，**P<0.01。

3.2 不同含药血清对LDH 、NO、ET-1、tPA、PAI-1的影响

与模型对照组相比，各实验组含药血清均能降低LDH的活性和ET-1含量，增加NO的分泌(P<0.05或P<0.01)，3 d、5 d、7 d组tPA分泌增加，PAI-1含量降低，PAI-1的分泌显著减少(P<0.05或P<0.01)，且存在时间依赖关系，结果见表2。

组别LDH(U/L)NO(μmol/L)ET-1(pg/ml)tPA(ng/ml)PAI-1(ng/ml)空白对照组587.49±42.60**54.85±4.46**47.89±4.60**59.60±5.33**46.26±4.45**模型对照组886.26±64.2831.53±2.8574.29±7.5240.62±4.0275.37±6.73单次给药组765.20±52.23*36.02±2.76*62.28±5.35*44.94±4.5165.24±6.323d给药组708.51±49.64**42.58±3.07**△55.89±4.96**52.80±4.76*54.65±4.94**△5d给药组672.65±45.31**△44.67±3.15**△52.07±4.88**△56.62±4.91**△50.29±5.21**△7d给药组674.82±47.69**△47.90±3.11**△52.64±4.73**△55.94±4.78**△49.15±5.39**△

注：与模型对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与单次给药组比较，△P<0.05。

4 讨论

自从日本学者Hiroko Iwama于1984年首次提出了血清药理学的概念，中药的体外药理研究有了新途径。血清药理学具有药效易于检测，避免中药本身对实验的影响，直接体现了中药及其代谢产物的药理作用等优点，在中医药药理作用机制的研究中显示出了明显优势。利用含药血清进行中药药理研究，如何能够采集到含药量较高的血清是非常重要的问题。不同的给药次数、间隔，都会影响血药浓度，所以进行时效关系研究对于制备含药血清是必要的[7-9]。

目前制备含药血清常用给药方案有：单次给药或间隔2～4 h分2次给药，或1天1～2次，连续3～10天[10-11]，还有每天给药2次，连续3 d，末次给药后1 h采血的“通法”[12]。我们通过比较连续3 d、5 d、7 d给药与仅单次给药后所制备的含药血清对过氧化氢损伤人脐静脉内皮细胞的存活率，同时对各组血清细胞分泌相关因子的影响，确定制备冠心止痛含药血清的最佳给药方案。结果表明，冠心止痛胶囊含药血清对H2O2诱导的HUVECs损伤具有显著的保护作用，连续3 d、5 d、7 d给药组的含药血清的药效明显强于单次给药，连续5 d、7 d组的含药血清的作用强于3 d组，但连续5 d、7 d组的含药血清药效无统计学差异，因此制备冠心止痛胶囊含药血清的最佳方案为2次/d连续5 d给药。

基于以上，我们认为制备含药血清不能套用其他药物或者拘泥于传统的“通法”，中药成分多样，体内过程复杂，制备含药血清应该根据具体药物及实验情况而定，不仅要省时省力，更要保证所制备的含药血清的质量。对中药复方含药血清制备方法的研究，本实验只是一个初步的探讨，尚需更深入地研究。

[1] 张灵娜,林兵,宋洪涛.中药血清药理学、血清药物化学的研究概况及展望[J].中草药,2015,46(17):2662-2665.

[2] 陈赐慧,花宝金.关于中药血清药理学实验的几个问题和探讨[J].中华中医药学刊,2013,31(1):46-48.

[3] 黄霞,王守富,刘惠霞,等.冠心止痛胶囊对动脉粥样硬化模型大鼠的影响[J].中国实验方剂学杂志,2016,22(1):153-157.

[4] 梁瑞峰,王守富,宋献美.冠心止痛胶囊含药血清对过氧化氢损伤的人脐静脉内皮细胞的保护作用[J].中国中医急症,2015,24(11):1885-1887.

[5] 雷霞,迟英娇,赵冬梅,等.逍遥丸含药血清依赖雌激素受体促进鼠成骨细胞增殖作用的研究[J].中医药信息,2014,31(6):107-109.

[6] 杜清华,曹唯仪,王宏涛,等.土鳖虫活性组分对过氧化氢损伤血管内皮细胞的保护作用[J].中医药信息,2014,31(3):10-14.

[7] 林圆圆,杜武勋,张少强,等.基于血清药理学的中药复方时效关系研究[J].中医杂志,2013,54(14):1175-1178.

[8] 王倩，范文涛，贺又舜.地黄饮子含药血清对胎鼠海马神经干细胞迁移的影响[J].中医药学报，2015,43(1):8-10.

[9] 芦冲，张睿苏，高彦宇,等.半枝莲醇提物含药血清对人结肠癌HT-29细胞增殖、凋亡和周期的影响[J].中医药学报，2016,44(2):51-54.

[10] 李月婷,李靖,肖婷婷,等.基于中药血清药物化学及血清药理学方法探讨荭草保护心肌细胞氧化损伤的物质基础[J].中国实验方剂学杂志,2013,19(2):158-162.

[11] 柏立浩,张丽,沈健.二参加芪口服液含药血清对人肺癌A549细胞的抑制作用及机制研究[J].中医药信息,2016,33(1):19-21.

[12] 李仪奎,吴健宇.血清药理实验中采血时间的通法方案[J].中国药理学通报,1999,15(6):569-570.

Effect of Medicated Serum Prepared with Guanxin Zhitong Capsule in Differents Time-effects on Human Umbilical Vein Endothelial Cells

LIANG Rui-feng1, SONG Xian-mei2, WANG Shou-fu3*, LU Ji-feng1

(1.HenanProvincialAcademyofTraditionalChineseMedicine,Zhengzhou450004,China;2.HenanMedicalCollege,Zhengzhou451191,China; 3.TheAffiliatedHospitalofHenanProvincialAcademyofTraditionalChineseMedicine，Zhengzhou450004，China)

Objective:To study the effect of medicated serum prepared with Guanxin Zhitong capsule in different time-effects on human umbilical vein endothelial cells. Methods:The oxidative injury models induced by H2O2were established by human umbilical vein endothelial cells and then the cell viability, lactic dehydrogense, nitric oxide,endothelin-1, tissue plasminogen activator and plasminogen activator inhibitor-1 were analyzed. They were used to study the time-effect of medicated serum prepared with Guanxin Zhitong capsule. Results:Medicated serum prepared with Guanxin Zhitong capsule had a significantly protective effect on HUVECs injured by H2O2. The 3d group, 5d group and 7d group were better than the single administration group according to protecting HUVECs, while the latter two groups were better than the 3 d group. However, there was no significant difference between 5 d group and 7 d group according to the protective effect on HUVEC injured by H2O2. Conclusion:There is a time-effect relationship of medicated serum prepared with Guanxin Zhitong capsule for the treatment of HUVECs injured by H2O2. Administration with two times per day for five days has the optimal efficacy.

Guanxin Zhitong capsule; Medicated serum; Time-effect relationship; Hydrogen peroxide

国家中医药管理局重点学科建设项目(No.国中医药发[2009]30号)；国家中医药管理局中医心病学重点学科基础研究课题(No.1304483)；河南省省属科研机构预研专项基金(No.201504552)

梁瑞峰(1983-)，男，助理研究员，主要研究方向：中药药理。

王守富*(1964-)，男，主任医师，主要研究方向：中医防治心血管疾病。

2016-06-06

R285.5

A

1002-2406(2017)01-0049-03

修回日期：2016-07-10