牛副流感病毒3型实验室检测方法研究进展

庄金秋，梅建国，张 颖，莫 玲，刘吉山

（山东省滨州畜牧兽医研究院，滨州 256600）

综述与专论

牛副流感病毒3型实验室检测方法研究进展

庄金秋，梅建国，张 颖，莫 玲，刘吉山

（山东省滨州畜牧兽医研究院，滨州 256600）

牛呼吸道疾病综合征是引起世界范围内饲养牛发病和死亡的主要原因，严重危害着世界养牛业的发展。牛副流感病毒3型是引起牛呼吸道疾病综合征的主要病原之一，主要引起成年牛和犊牛的肺炎、支气管肺炎等。文章综述了近年来牛副流感病毒3型的最新实验室检测方法研究进展，以期为预防和控制疾病提供参考。

牛副流感病毒3型；牛呼吸道疾病综合征；检测；研究进展

牛呼吸道疾病综合征（bovine respiratory disease complex，BRDC）是引起世界范围内饲养牛发病和死亡的主要原因，严重危害着世界养牛业的发展。牛副流感病毒3型（bovine parainfluenza virus type 3，BPIV3）与牛呼吸道合胞体病毒（bovine respiratorysyncytialvirus，BRSV）、牛病毒性腹泻病毒（bovine viraldiarrhea virus，BVDV）、牛传染性鼻气管炎病毒（infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV）一起构成了BRDC的主要病原。BPIV3通常被称为“运输热”病毒，为副黏病毒科呼吸道病毒属的成员。BPIV3感染主要引起成年牛和犊牛的肺炎、支气管肺炎和被感染肺叶的实质性病变。此病在临床上主要表现为发热、流泪、流鼻涕和呼吸加快等症状。BPIV3最早分离于美国，目前在牛群中的感染已呈世界性分布。BPIV3有3个基因型，分别为A型、B型和C型，国内分离株主要为A型和C型。BPIV3本身致病力不强，但在其他继发性细菌（特别是多杀性巴氏杆菌或溶血性巴氏杆菌）及外界诱因（特别是长途运输中受寒、饥饿、拥挤、气候恶劣等）的联合作用下，则可产生严重呼吸道症状，甚至可引起病牛的死亡。目前我国对BPIV3的研究尚处于起步阶段，在临床预防和治疗中还没有安全、高效的疫苗和药物。本文综述了近年来BPIV3的最新实验室检测方法研究进展，以期为预防和控制疾病提供参考。

1 病原学检测方法

病原学检测方法最常用的为病毒的分离与鉴定，采集病牛的鼻拭子擦拭液或病变组织，经处理后接种牛肾传代细胞（MDBK）培养。BPIV3在细胞上通常会产生典型的细胞病变（CPE），如细胞融合和蚀斑等。有一些毒株不会产生明显的CPE，可以通过使用红细胞吸附试验来确认是否有病毒的存在，常用的方法有牛红细胞吸附试验法和豚鼠红细胞吸附试验法，但有些毒株要在体外适应一段时间后才能出现红细胞吸附现象。电镜观察BPIV3是具有囊膜的病毒，并且大小在150～250 nm。刘鹏［1］利用MDBK细胞从黑龙江某牛场病牛鼻液中分离到1株可产生特定的CPE，经过理化特性和核酸序列测定分析后确定为A型BPIV3。吕闯等［2］在我国山东省首次分离到基因C型的BPIV3。

2 血清学检测方法

2.1 血凝和血凝抑制试验（HA和HI）

副黏病毒为主要的红细胞凝集性病毒，BPIV3可以凝集鸡、豚鼠和人的“O”型红细胞，根据这一特性可以鉴定BPIV3。由于牛血清具有非特异性的血凝抑制活性，在进行HI试验前应进行预处理，以消除非特异性反应。BPIV3感染程度较轻的牛不出现临床症状，但HI效价一般可达1∶40；感染后出现临床症状的牛血清的HI效价则可达1∶640，甚至更高。在检测时最好有急性期和康复期的双份血清的结果才有说服力。HA和HI试验因成本低、操作方便、能在短时间内获得结果等优点而成为该病毒常用的检测方法，但BPIV3在保存和运输过程中均存在很大的变异性，试验往往会导致假阴性的误判。

2.2 免疫荧光试验

王海勇［3］初步建立了检测BPIV3的直接免疫荧光方法，具有良好的敏感性和特异性，检测到BPIV3的最小剂量为10 TCID50/mL，为BPIV3抗原的检测提供了重要的手段。

2.3 中和试验

中和试验是经典的鉴定BPIV3的血清学检测方法。霍志云等［4］为了解我国北方3省（区）牛副流感病毒3型的感染状况，从内蒙古、吉林、山西3个省采集牛血清样品482份，采用病毒中和试验方法进行BPIV3抗体检测。结果482份血清中BPIV3阳性共439份，阳性率为91.08%，表明这3省（区）牛群中普遍存在BPIV3的感染。王海勇等［5］从黑龙江、辽宁、新疆、云南、贵州、广西、河北、山东、河南、江西、湖南和福建12个省份采集牛血清样品2 489份，采用血清中和试验进行BPIV3抗体检测，结果除江西省血清样品阳性率为27.8%之外，其他省份阳性率均高于50%；2 489份血清样品中阳性样品数为1 932份，总体阳性率为77.6%。表明BPIV3在我国流行比较广泛，迫切需要对该病毒进行深入研究以有效防控BPIV3感染。中和试验准确性高，许多新建立的方法必须都以该方法作为标准进行比较。但是，该方法操作复杂，试验周期长，限制了其在临床上的快速诊断。

2.4 ELISA

吴海涛［6］和史鸿飞［7］分别用原核表达的BPIV3 HN蛋白和N蛋白作为包被抗原初步建立了检测BPIV3抗体的间接ELISA方法。刘鹏［1］利用纯化后的重组N蛋白作为包被抗原，建立了间接ELISA方法。应用该法对黑龙江省部分地区的603份牛血清样本进行检测，BPIV3的抗体阳性率为78.44%。周玉龙等［8］以原核表达的BPIV3 HJ-1株重组HN蛋白为包被抗原，建立了间接ELISA方法，与病毒中和试验符合率高达96%。吕闯［9］用碳酸盐缓冲液（CBS）将BPIV3粗分离病毒液作200倍稀释包被ELISA板，以制备的BPIV3核衣壳蛋白的5E5单抗为待阻断抗体，通过方阵滴定试验确定最佳反应条件，初步建立了固相阻断ELISA（SPB-ELISA），对231份免疫牛血清及54份来自哈尔滨周边地区的牛血清进行抗体检测，结果免疫牛血清中阳性血清样品数为220份，阳性率为95.2%；哈尔滨周边地区牛血清中阳性血清样品数为34份，阳性率为62.9%。任建乐［10］成功制备了7株针对NP蛋白的单克隆抗体，并对其中效价高的5株单克隆抗体进行了表位鉴定，鉴定出两个抗原表位。用针对上述两个不同抗原表位的单抗6F8和7G9建立了双抗体夹心ELISA（DAS-ELISA）方法。李丽阳等［11］以纯化的兔抗BPIV3多克隆抗体（PAb）作为包被抗体，鼠抗BPIV3单克隆抗体（MAb）作为检测抗体，采用棋盘滴定法确定DAS-ELISA的最适工作条件，建立了BPIV3双抗体夹心ELISA方法。利用该方法和RT-PCR法对75份牛鼻拭子临床样品进行检测，两者符合率为94.6%。杨建乐等［12］通过分析NP和HN蛋白主要抗原表位区并对其串联后原核表达，以纯化的重组蛋白为包被抗原建立了间接ELISA方法，对采自山东、辽宁和天津的270份临床血清样本检测后总的阳性率为82.59%（223/270）。ELISA方法适用于兽医基层临床样品的大规模检测。

3 分子生物学检测方法

3.1 RT-PCR

Vaucher等［13］根据BPIV3的HN基因的保守区域设计引物建立了RT-PCR方法，在所有的检测样品中都能够检测到大小为1 009 bp的目的条带。国内刘鹏［1］根据BPIV3HN基因序列设计引物，建立了RT-PCR方法。刘晓乐等［14］分别针对BPIV3NP蛋白和BVDV E2基因设计2对引物，经优化反应条件建立了快速鉴别BPIV3和BVDV的双重RT-PCR方法，BPIV3的敏感度可达10-3TCID50/0.1mL。Thonur等［15］针对IBRV的糖蛋白B基因、BRSV核衣壳基因、BPIV3的核蛋白基因设计的多重反转录定量PCR（mRT-qPCR），通过对临床541份样品检测与传统的病毒分离和间接免疫荧光抗体试验技术比较，证明了该方法更快速，特异性高，并且比病毒分离和间接免疫荧光抗体技术更加敏感。索阳等［16］选择BVDV的5′UTR序列附近保守核苷酸序列，BRSV的F基因的保守区及BPIV3高度保守性NP蛋白基因设计引物，建立了可用于检测上述3种病毒的三重RT-PCR方法。该三重RT-PCR技术能检出10 pg的BVDV、1pg的BPIV3和10 pg的BRSV。倪宏斌等［17］从新疆石河子、奎屯、库尔勒、沙湾、阿克苏地区的5个规模化奶牛场采集1月龄以内犊牛鼻液206份，其中发病犊牛180份，相同日龄健康犊牛46份，通过采用双抗体夹心ELISA的方法检测BPIV3抗原，RT-PCR方法检测BPIV3M基因，并挑选不同地区的8株病毒进行序列分析比较其同源性，进行基因分型。结果ELISA方法检测的感染率仅为2.43%，PCR方法检测的感染率为35.44%。扩增的M基因序列同源性为97.90%，与参考的BPIV3 A亚型毒株的同源性为96.4%～99.6%，将其划分为BPIV3 A亚型。

3.2 荧光定量RT-PCR

董秀梅等［18］基于BPIV3M基因设计引物及探针，建立了Taq Man实时荧光定量RT-PCR检测方法，用于快速定量检测BPIV3。

3.3 RT-LAMP

师新川等［19］依据BPIV3NP基因保守序列设计4条特异性引物，建立了RT-LAMP方法，整个反应过程只需60min，检测最低限达0.069 fg/μL，为普通RT-PCR灵敏度的1 000倍。在反应体系中添加荧光染料后，可通过肉眼直接判断有无扩增产物而不需要凝胶电泳，在基层的快速检测中具有较好的应用前景。

3.4 液相芯片技术

Anderson等［20］用美国Luminex公司研制的液相芯片技术设计了多重检测牛血清抗体技术，可以在一个血清样本中同时检测病原BVDV、IBRV、BPIV3、BRSV相应的抗体，并与ELISA相比较，其敏感度、特异性基本一致，实现了一个液相反应体系下检测多种病原抗体的技术，该技术最高可同时检测多达100种病原，在未来传染病诊断技术中有很好的应用前景。

4 小结

目前我国牛群中已经普遍存在BPIV3的感染，严重危害着养牛业的健康发展。由于此病尚无特效治疗药物和方法，且随着我国养牛业的集约化发展，不少牛舍养殖密度大、空气质量差，这些因素的存在为该病的传播和流行提供了可能。本文所述的检测方法各有优缺点，在实际应用中可以根据具体情况及对检测结果的要求来选择合适的检测方法，也可以将多种方法结合使用。随着检测方法的不断改进以及新技术的不断创新，BPIV3的检测方法也将日趋发展完善，相信研制更加灵敏、特异、方便、适用于基层的检测技术指日可待，这必将为预防牛呼吸道疾病的发生具有重要意义。

［1］ 刘鹏.牛副流感病毒3型的分离鉴定和间接ELISA方法建立及初步应用［D］.黑龙江大庆：黑龙江八一农垦大学，2010.

［2］ 吕闯，朱远茂，董秀梅，等.牛副流感病毒3型NP单抗的制备及初步应用［J］.中国预防兽医学报，2011，33（12）：970-973.

［3］ 王海勇.牛副流感病毒3型血清学调查及其单克隆抗体的制备与应用［D］.北京：中国农业科学院，2014.

［4］ 霍志云，童钦，胡嘉欣，等.北方三省（区）牛副流感病毒3型的血清学调查［J］.动物医学进展，2012，33（9）：124-126.

［5］ 王海勇，童钦，王炜，等.我国牛副流感病毒3型血清学调查［J］.中国预防兽医学报，2014，36（2）：154-156.

［6］ 吴海涛.牛副流感病毒3型的分离鉴定和间接ELISA方法建立及初步应用［D］.黑龙江大庆：黑龙江八一农垦大学，2010.

［7］ 史鸿飞.牛副流感病毒3型山东分离株核衣壳蛋白表达鉴定、多抗制备及应用［D］.北京：中国农业科学院，2010.

［8］ 周玉龙，任亚超，朱战波，等.牛副流感病毒3型HN基因原核表达及间接ELISA方法建立［J］.病毒学报，2012，28（1）：23-28.

［9］ 吕闯.牛副流感病毒3型NP单抗制备及固相阻断ELISA的建立和应用［D］.北京：中国农业科学院，2012.

［10］任建乐.牛副流感病毒3型NP蛋白单抗制备及其抗原表位鉴定与双抗夹心ELISA建立［D］.北京：中国农业科学院，2015.

［11］李丽阳，李艳婷，余丽芸，等.牛副流感病毒3型双抗体夹心ELISA检测方法的建立［J］.中国预防兽医学报，2016，38（2）：132-136.

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［13］Vaucher R D，Simonetti A B，Roehe PM.RT-PCR for detection of bovineparainfluenza virus type3（BPIV-3）［J］.Acta Scientiae Veterinariae，2008，36（3）：215-220.

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［15］ Thonur L，Maley M，Gilray J，et al.One-step multiplex real time RT-PCR for the detection of bovine respiratory syncytial virus，bovine herpesvirus 1 and bovine parainfluenza virus 3［J］.BMC Veterinary Research，2012，8：37-45.

［16］索阳，陈继勇.牛病毒性腹泻病毒、牛呼吸道合胞体病毒和牛副流感病毒3型三重RT-PCR检测方法的建立及应用［J］.畜牧与兽医，2013，45（6）：10-13.

［17］倪宏斌，剡根强，张坤，等.新疆部分地区牛副流感病毒3型的检测与基因分型［J］.畜牧与兽医，2016，48（12）：72-75.

［18］董秀梅，朱远茂，蔡虹，等.牛副流感病毒3型TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用［J］.中国兽医科学，2014，44（6）：617-623.

［19］师新川，温永俊，王凤雪，等.牛副流感病毒3型RT-LAMP检测方法的建立及应用［J］.中国畜牧兽医，2012，39（11）：31-34.

［20］Anderson S，Wakeley P，Wibberley G，etal.Developmentand evaluation ofa Luminexmultiplex serologyassay todetectantibodies tobovine herpes virus 1，parainfluenza 3 virus，bovine viral diarrhoea virus，and bovine respiratory syncytial virus,with comparison to existing ELISA detection methods［J］.Journal of Immunological Methods，2011，366（1-2）：79-88.

Progress in the Detection Methodsof the Bovine Parainfluenza Virus Type 3

Zhuang Jinqiu，Mei Jianguo，Zhang Ying，etal
（Binzhou AcademyofAnimalScience&VeterinaryMedicine，Binzhou 256600，Shandong，China）

Bovine respiratory disease complex is themain causeof themorbidity andmortalityof feeding cattle in theworld,which seriously endangers the developmentof theworld's cattle industry.Bovine parainfluenza virus type 3 isoneof themajor causesof bovine respiratory disease complex,whichmainly causes pneumonia and bronchopneumonia in adultcattle and calves.This paper reviewed the latest laboratory detectionmethodsofbovine parainfluenza virus type 3 in recentyears,so as to provide reference for prevention and controlofdisease.

bovineparainfluenzavirus type3；bovine respiratory disease complex；detection；progress

S858.23

A

2095-3887（2017）04-0046-04

10.3969/j.issn.2095-3887.2017.04.013

2017-06-01

山东省重点研发计划项目（2015GSF121027）；山东省现代农业产业技术体系牛产业创新团队项目（SDAIT-09-12）

庄金秋（1978-），女，副研究员，硕士，主要从事细胞培养和动物用病毒疫苗研制。