阿尔巴斯白绒山羊超数排卵和冷冻胚胎生产技术研究

陶萨茹拉，李春生，乌力吉，解 军，何托雅，马莉梅，王 莉，杜建儒，莫 仁，康凤祥，邢玉梅，何云梅，吉日嘎拉

（1.内蒙古鄂尔多斯市家畜改良工作站，东胜 017000；2.内蒙古自治区畜牧总站，呼和浩特 010010；3.内蒙古鄂尔多斯市鄂托克旗家畜改良工作站，乌兰 017002）

阿尔巴斯白绒山羊超数排卵和冷冻胚胎生产技术研究

陶萨茹拉1，李春生1，乌力吉1，解 军1，何托雅1，马莉梅1，王 莉1，杜建儒1，莫 仁1，康凤祥2，邢玉梅2，何云梅3，吉日嘎拉3

（1.内蒙古鄂尔多斯市家畜改良工作站，东胜 017000；2.内蒙古自治区畜牧总站，呼和浩特 010010；3.内蒙古鄂尔多斯市鄂托克旗家畜改良工作站，乌兰 017002）

为了更好地保护阿尔巴斯白绒山羊这一优良的地方品种，采取同期发情及超数排卵技术，对34只羊进行了手术法胚胎回收。结果表明：34只供体羊共冲出胚胎244枚，其中可用胚胎215枚，冷冻胚胎215枚，共封装冷冻99管。

阿尔巴斯白绒山羊；超数排卵；冷冻胚胎

阿尔巴斯白绒山羊是经过长期的自然选择和人工选育而形成的地方良种，所产羊绒以细、长、柔软而著称，素有“纤维宝石”之美誉，是世界一流的绒肉兼用型品种。

近年来，由于政府部门没有出台“优绒优价”的收购政策，阿尔巴斯白绒山羊养殖户受短期利益的驱动，加之饲养成本成倍增加，当地养殖户片面追求羊绒产量，竭力提高羊绒单产，无计划地引入其他品种的绒山羊进行杂交，导致其羊绒直径变粗，使阿尔巴斯白山羊这一优良品种资源面临混杂的危险。因此，通过本试验胚胎冷冻保存，建立阿尔巴斯白绒山羊基因库，可以起到长期保护这一优良地方品种的作用［1］。

1 材料与设备

1.1 试验动物

1.1.1 供体羊选择

供体公羊：绒细度在15 μm以下、产绒量1 000 g以上的优质阿尔巴斯白绒山羊6只。

供体母羊：绒细度在14.5 μm以下的优质阿尔巴斯白绒山羊34只。

1.1.2 受体羊选择 受体羊选择体型较大，繁殖率较高，哺乳力较强，母性和适应性强的健康羊只。

1.2 设备及药剂

器材、仪器：白纱布，手术刀，镊子，大头针，三棱针，三通管，缝合线，刮毛刀，注射器，培养皿，移液枪，枪头；显微镜，恒温箱，恒温水浴锅，烘干箱，高压灭菌锅，净水仪，数码照相机，恒温台［2］。

药品：阴道栓（CIDR栓），前列腺素（PG），孕马血清（PMSG），促卵泡素（FSH），促黄体素（LH），麻药，磷酸盐缓冲液（PBS），保存液，酒精，新洁尔灭，石蜡油，孕马血清促性腺激素，乙二醇［2］。

冷冻液配制方法

I液：PBS缓冲液；II液：乙二醇∶保存液=1∶2；III液：乙二醇∶保存液=2∶1；IV液：乙二醇［3］。

2 方法

2.1 供体羊超数排卵

CIDR+FSH+PG法：在母羊发情周期的任意一天阴道放入CIDR栓，记为0 d，然后从第10天开始肌注FSH，时隔12h早晚各等量注射一次，常以递减法连续注射3d。在第5次注射FSH的同时注射PG，并撤出CIDR栓。次日开始试情并对发情母羊进行人工授精，并注射LH［1］。

2.2 胚胎的采集及检测

在配种后第6.5天，通过手术法回收胚胎，并对胚胎进行质量鉴定，划分等级［4］。

2.3 胚胎冷冻

2.3.1 胚胎清洗及平衡 采用常规冷冻法进行冷冻。将胚胎收集好后，鉴定，将A级、B级桑葚胚或囊胚洗净后移入II液中停留6～7min，再取出放入III液中停留6～7min，使细胞内部抗冻剂浓度基本达到饱和。最后移入IV液中准备冷冻［5］。

2.3.2 胚胎装管 将胚胎和冷冻液按照乙二醇溶液→空气→含有胚胎的乙二醇溶液→空气→乙二醇溶液的顺序吸入提前标记好供体号和冷冻日期的0.25细管中，再在细管外标记胚胎数量和等级［6］。

2.3.3 胚胎冷冻和植冰 将细管直接浸入冷冻的液氮浴槽内，选择程序，以1℃/min的速度从室温降至-6℃，停留5 min后用顶端缠好棉花冷冻过的镊子捏住细管一端植冰，再保留10 min，以0.3℃/min的速度降至-36℃，再以0.1℃/min的速度降至-38℃，在液氮中熏蒸短时间后，直接投入液氮，长期保存［6-7］。

3 结果

3.1 供体母羊胚胎采集情况

供体母羊冲胚共34只，总冲出胚胎244枚，其中可用胚胎215枚，A级胚胎208枚，二级胚胎7枚；胚胎可利用率88.11%，供体平均冲胚7.18枚/只，只均冲出可利用胚6.32枚。

3.2 胚胎冷冻情况

共冷冻胚胎215枚，其中桑葚胚7枚（3.26%）,紧缩桑葚胚172枚（80%），早期囊胚9枚（4.19%），囊胚20枚（9.30%），扩张囊胚7枚（3.25%），封装冷冻99管。

4 分析与讨论

（1）利用胚胎冷冻保存可建立家畜和濒危动物基因库，免受各种灾害造成品种灭绝的危险。阿尔巴斯白绒山羊作为一个优良的地方品种，近年来由于受绒价下跌的影响，牧民为了追求更高的经济效益，使用绒纤维粗、产绒量高的品种进行杂交的现象严重，所以除通过政府补贴及建立保护区等形式鼓励牧民保护这一优良地方品种外，胚胎冷冻保存也是很好的保护措施之一。

（2）研究表明，发情后6.5 d采集的胚胎均处于紧缩桑葚胚至早期胚泡阶段，此时的胚胎解冻后的存活率可高达91.18%，远远高于孵化囊胚解冻后的存活率，表明冷冻胚胎的最佳采集时间为供体羊发情后的6.5 d［3］。

（3）胚胎程序化冷冻是指将胚胎移入含低浓度抗冷冻剂的冷冻保存液中，通过程序冷冻控制仪使胚胎缓慢降温，以诱导胚胎外液形成冰晶，胚胎内形成玻璃化状态，而使胚胎存活的技术［1］。这是目前胚胎冷冻最常用的一种方法。庞彦等［8］的研究证明，对于桑葚胚的冷冻，程序化冷冻方法的形态正常率高于玻璃化冷冻；在发育率方面，程序化冷冻桑葚胚、解冻后发育率也高于玻璃化冷冻方法。本研究大部分胚胎为桑葚胚，所以根据上述研究结果，选择了程序化冷冻方法进行冷冻保存。

（4）程序化冷冻过程缓慢，时间较长使细胞内水分的渗出、胚胎保护剂的渗入和冰晶的形成达到一定的平衡状态，所以形成的冰晶数量极少，从而不会对胚胎造成致命的伤害［8］。但是此过程必须依赖昂贵的冷冻仪才能完成，成本较高，而且冷冻过程较长，在冷冻数量较多的情况下花费的时间较长［9］。

［1］朱士恩.家畜繁殖学［M］.6版.北京：中国农业出版社，2015：232-243.

［2］庞春英，杨春艳，李日聪，等.不同冷冻方法对水牛体外生产胚胎冷冻效果的研究［C］//中国畜牧兽医学会动物繁殖学分会第十五届学术研讨会论文集.天津：中国畜牧兽医学会，2010：23-28.

［3］赵霞.纯种肉羊超数排卵和胚胎冷冻试验［J］.黑龙江动物繁殖，2007（5）：21-22.

［4］中华人民共和国农业部.绵羊胚胎移植技术规程：NY/T826—2004［S］.北京：中国农业出版社，2004.

［5］赵霞.纯种肉羊超数排卵和胚胎冷冻技术的研究［J］.畜牧与饲料科学，2007（5）：32-33.

［6］余文丽，李树静，包呼格吉乐图，等.牛胚胎一步细管冷冻解冻技术的研究和应用［J］.中国畜牧杂志，2000，36（2）：45.

［7］李武，王健，丛慧敏，等.优质肉羊冷冻胚胎移植应用技术研究［J］.黑龙江畜牧兽医，2002（8）：10-11.

［8］庞彦，张胜.牛、羊胚胎冷冻方法探讨［J］.兽医导刊，2011（S1）：229-230.

［9］杨中强，朱士恩.不同冷冻和解冻方法对小鼠桑葚胚发育的影响［J］.中国畜牧杂志，2006，12（1）：5-8.

S827.3

A

2095-3887（2017）02-0064-02

10.3969/j.issn.2095-3887.2017.02.021

2017-01-10

内蒙古现代农牧业科技服务体系绒毛用羊示范推广团队建设项目；鄂尔多斯市绒山羊选育提高项目

陶萨茹拉(1983-)，女，中级畜牧师，硕士研究生。

乌力吉(1968-)，男，副高级畜牧师，副站长。