猪传染性胃肠炎诊断技术的研究进展

杨 伟，汤德元，曾智勇，王 彬，黄 涛，胡玲玲，龙冬梅，石远菊，叶 丽（贵州大学动物科学学院，贵州 贵阳 550025）

猪传染性胃肠炎诊断技术的研究进展

杨 伟，汤德元*，曾智勇，王 彬，黄 涛，胡玲玲，龙冬梅，石远菊，叶 丽（贵州大学动物科学学院，贵州 贵阳 550025）

猪传染性胃肠炎（TGE）是由猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）引起猪只的一种高度接触性胃肠道传染病，临床症状主要表现为腹泻、呕吐和脱水，该病为影响养猪业健康发展的重要疫病之一，世界动物卫生组织将其列为法定报告的B类动物疫病。近年来，国内外许多研究者在对猪传染性胃肠炎的诊断与检测方法上进行了大量的研究，并建立了相关的实验室诊断检测技术，这些检测技术主要包括病理诊断、病毒的分离鉴定、电镜检测、血清学诊断和分子生物学诊断方法等。本文对猪传染性胃肠炎主要的诊断技术进行了综述，以期为该病在临床的快速诊断及防控提供参考。

猪传染性胃肠炎；病原学；血清学；分子生物学；诊断

猪传染性胃肠炎（TGE）是由猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）引起猪只的一种高度接触性胃肠道传染病，TGEV破坏小肠上皮细胞而引起肠绒毛萎缩，该病临床主要表现为腹泻、呕吐和脱水，对不同猪种和不同年龄的仔猪都易感，而对成年猪的危害性相对较小。该病在1946年由Doyle和Hutchings[1]在美国首次报道，随后在世界许多国家和地区相继报道了本病的发生；我国在20世纪60年代首次报道了TGE在我国的流行；近年来我国各地不同程度地暴发了猪传染性胃肠炎，给生猪养殖产业带来了巨大的经济损失。由于猪传染性胃肠炎（TGE）与猪流行性腹泻(PED)在临床症状、流行病学等方面的表现非常相似，给临床诊断以及防治都带来了一定困难。因此，掌握TGE检测技术对该病的诊断和防治均有重要的意义。猪传染性胃肠炎的实验室诊断主要包括病理诊断、病毒的分离鉴定、电镜检测、血清学诊断和分子生物学诊断方法，现就这些诊断技术的研究进展综述如下。

1 TGE的临床及病理诊断

1.1 临床诊断

根据流行病学调查、发病猪临床症状观察和病理变化进行综合诊断。TGE临床症状为仔猪突然性呕吐，水样腹泻。开始是灰白色粪便，然后变为黄绿色粪便，粪便中夹杂有未消化的凝乳块，病程较久时，会出现脱水。日龄越小，病程越短，死亡率越高，随着日龄的增长病死率逐渐降低。仔猪食欲下降，拒食；1日龄内新生仔猪发生腹泻后3～4 d，呈现严重脱水而死亡，发病死亡率很高（可达100%）。保育猪、母猪症状轻重不一，其中症状轻的，超过3周龄的猪通常能够自行恢复，但也影响发育；母猪患该病会导致泌乳量减少，因与患病仔猪长期接触、反复感染而发病严重，体温升高、呕吐、腹泻和厌食；与患病仔猪无接触的母猪通常仅有轻微症状或无症状。

1.2 病理剖检诊断

TGE剖检的主要病变集中在胃肠道。眼观从胃到直肠可见程度不一的卡他性炎症。胃肠充满凝乳块，胃黏膜溃烂；小肠充满气体，肠壁弹性下降，管壁变薄，呈透明或半透明状，或有充血、出血及溃疡等症状；肠内容物呈泡沫状、黄色、透明。小肠上皮细胞大量脱落坏死，肠绒毛变短和萎缩；正常仔猪的空肠中绒毛长度：利贝昆滤泡的深度比值是7∶1，但是在被感染TGEV的仔猪体内这个比值的大小仅仅约为1∶1；肠绒毛萎缩也常见于轮状病毒腹泻，但一般不如TGEV严重[2]。肠系膜淋巴结肿胀、充血、出血，淋巴管没有乳糜。心脏，肺脏，脾脏，肝脏，肾脏未见明显的眼观病理病变。

2 实验室诊断

2.1 病毒的分离鉴定

TGEV的分离鉴定通常用乳猪接种试验和细胞培养2种方法。用经处理的病毒口腔感染仔猪是分离TGEV最敏感的方法，该法只有结合流行病学做出初步诊断，不排除有其他病毒感染的可能，且成本、环境及人员技术要求较高，因此，常采用细胞培养进行病毒的分离鉴定。猪肾细胞（PK15）和猪睾丸细胞（ST）是实验室最常用的细胞。在ST或猪甲状腺细胞上的典型细胞病变现象（CPE），呈现膨胀、圆形或长形外观如气球的细胞组成。第一次接种细胞可能没有明显的细胞病变（CPE），往往需经连续盲传几代后，才能使细胞发生特征性病变。Pocock和Garwes报道，当次代猪甲状腺细胞用弱酸性营养液时，TGEV增殖滴度最高。同时，为了提高病毒对细胞的吸附，在细胞培养液中添加二甲基亚砜（DMSO）等化学试剂可以明显提高细胞对病毒的敏感性，从而提高病毒的分离成功率。

2.2 电镜观察

用电镜检测 TGEV也是常用的诊断方法之一。通过电镜观察（EM），病毒多分布在胞浆的空泡里和微绒毛间隙，在微绒毛间的病毒往往呈串球状排列。电镜检测显示：除脾脏外，病毒大量分布于病猪的各种器官中，在小肠中含毒量最高。由于TGEV与PEDV等为代表冠状病毒形态十分相似，仅仅通过电镜观察无法鉴别诊断，免疫电镜法（IEH）可以更敏感确切地检测临床样品或细胞培养物中的TGEV，并可提供病毒血清学鉴定。1999年王继科等[3]利用免疫电镜（IEH）观察和分析，从形态上的细微差异鉴别TGEV和PEDV，为鉴别这两种病毒粒子建立了初步诊断意义；江春霞[4]将TGEV细胞毒接种于原代猪肾细胞，进行超薄细胞切片电镜、直接负染电镜、免疫电镜，在电镜下清晰的观察到TGEV病毒粒子。

2.3 血清学诊断

2.3.1 免疫荧光检测

荧光抗体检测（IFA）TGEV是一种灵敏性和特异都较好的诊断方法；此方法主要从小肠上皮细胞、肠内容物或粪便中检测TGEV。马思奇等[5]用免疫荧光直接法检查扁桃体应用于活体诊断TGEV，提高了检出率，既适用于早期感染，也适用于慢性或隐性带毒猪的诊断；赵鑫等[6]用抗TGEV的N蛋白单克隆抗体，为TGEV 检测方法的建立和N 蛋白功能的分析奠定了基础；利用所制备的单克隆抗体进行间接免疫荧光对病原检测具有较高的特异性，为鉴别诊断TGEV与PRCV（猪呼吸道冠状病毒）的阻断ELISA方法的建立打下了前期基础，为TGEV与PRCV的血清学诊断提供了材料[7]。朱蕴暖等[8]建立了TGEV特异性的间接免疫荧光检测法，对TGEV的实验室诊断及TGEV在感染细胞中的定位和动态分布提供了有效的检测手段。

2.3.2 中和实验

中和试验（SN）最早于1969年由Carbrey等人建立，其原理是病毒或毒素与相应的抗体结合后，失去对易感细胞的感染性，被称为中和试验。中和试验主要用于：1）从待检血清中检出抗体，或从病料中检出病毒，用于诊断传染性病毒病；2）用抗毒素血清检查样品中的毒素或区分细菌的毒素类型；3）测定抗病毒血清或抗毒素效价；4）新分离病毒的鉴定和分型。中和试验通常采用猪睾丸细胞系或猪肾细胞系培养，可作大量细胞试验，或应用微量培养板培养单层细胞进行微量中和试验。TGE病猪的中和抗体通常在感染后7～9 d开始出现，21 d能达到相当水平并逐渐增加，愈后血清的中和抗体持续时间较长，试验通常采用病毒定量，血清变量法。董志珍等[9]建立以狗直肠瘤(A72细胞)进行TGEV血清中和试验的方法，证实了A72细胞可以准确清晰地反应TGEV感染，其敏感性和准确性优于PK15细胞，且猪TGE血清中和试验与酶联免疫吸附检测结果试验的重复性较好。

2.3.3 酶联免疫吸附试验

酶联免疫吸附试验（ELISA）是国际贸易指定标准诊断TGE方法之一，ELISA具有灵敏性高、特异性好等优点，是当前应用最广泛的一种免疫学检测方法。Carman 等[10]用 B-ELISA 诊断TGE 抗体，可同时区分 TGEV 和PRCV的抗体，取得了良好效果。钟涛等[11]利用重组N蛋白作为诊断抗原，建立了一种快速的TGEV抗体间接ELISA检测方法，可用于免疫猪群TGEV的监测和诊断。邹勇等[12]建立了同时检测和鉴别猪流行性腹泻病毒、TGEV和轮状病毒抗体的ELISA技术。姜骞等[13]将重组TGEV的N基因利用大肠埃希氏菌进行原核表达，经Ni-NAT层析柱纯化获得N蛋白，以该蛋白制备抗原，建立了Dot-ELISA诊断技术，用肉眼即可判定结果， 无需特殊设备条件，快速简便， 适合基层进行抗体检测。

2.4 分子生物学诊断方法

2.4.1 RT-PCR诊断

RT-PCR成为一种应用非常普遍、特异、敏感的检测方法，可从微量的核酸样品中检测出RNA序列，根据PCR产物的电泳结果和预测的核酸分子量大小对比，可以判定检测样品中是否有TGEV的存在，优于传统的血清学和免疫学方法。RT-PCR技术能快速检测感染组织中的猪传染性胃肠炎病毒。Woods等 ( 1997年) 建立了TGEV的RT- PCR 检测技术，结果证实 RT- PCR是一种非常特异、敏感的诊断方法。李军等[14]建立了检测TGEV的RT- PCR方法，可检出l pg的TGEV RNA含量。赵雯雯等[15]利用国内外已发表TGEV和PEDV基因序列和相关RT-PCR方法，根据TGEV的S基因和PEDV的S基因各设计一对特异性通用引物，建立了TGEV和PEDV二联RT-PCR检测方法，为TGEV和PEDV的检测和流行病学调查奠定了基础。沈海蛾等[16]应用套式PCR检测和区分TGEV和PRCV的试验中发现，该种方法特异性强 ，能够区 分 PRV、PRCV、PEDV、TGEV、CSFV、PRRSV和PPV等多种病毒。

2.4.2 多重RT-PCR技术

多重 PCR可用于同时检测两种或两种以上的病毒，具有高效性、系统性和经济简便性。多重PCR法是采用多对引物，在一个反应中扩增多种靶序列，解决了逐一分离每个待测样品中病毒的问题。Jung等[17]为了增强鉴别诊断 PEDV和TGEV方法的灵敏性，在多重 RT-PCR 技术的基础上建立了斑点杂交技术。Kim O和Choi C[18]用改进的多重 RT-PCR方法来区分PEDV和TGEV，在 RT-PCR反应体系中分别加入了针对TGEV和PEDV基因特定保守区域的两对引物，两者通过 RTPCR 反应的产物分别为412个bp和612个bp的 DNA目的片段，通过琼脂糖凝胶电泳可以鉴别PEDV和TGEV。2010年张坤和何启盖[19]建立了能同时检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪A群轮状病毒(GAR)的多重RT-PCR检测方法，该方法检测PEDV、TGEV、GAR的敏感性分别为92%、100%、100%， 特异性均为100%。该方法敏感性高、特异性强， 具有较高的实用价值， 可应用于临床鉴别诊断， 也为这3种病毒性腹泻的流行病学调查奠定了基础。

2.4.3 荧光定量RT-PCR技术

近些年来荧光定量 RT-PCR得到越来越多的应用，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。董玲娟等[20]根据TGEV的N基因序列设计了一对特异性引物，扩增目的片段，构建质粒，对荧光定量的反应体系和条件进行优化，建立了TGEV荧光定量RT-PCR检测方法，该方法的特异性高、重复性好、敏感性比普通PCR检测方法高2个数量级，可以对TGEV进行快速检测。肖文[21]选择TGEV的N蛋白基因突变小的区域，设计引物并克隆出阳性标准品，并通过得到的标准曲线建立的荧光定量RT-PCR方法，该方法能够检测出最低的TGEV的DNA含量为1.445×10-6ng/μL，与常规RT-PCR方法进行比较，得到该方法的敏感性比常规RT-PCR方法要高出约100倍。与常规 RT-PCR相比，荧光定量RT-PCR特异性更强、敏感性更高，假阳性率低，不易污染，且扩增与检测一步完成，不需要对产物进行电泳等后期处理，操作更简便。

2.4.4 限制性酶切片段长度多态性技术(RFLP)

RFLP 是一种区分具有抗原相关性病毒的试验方法，把抗原性相近的病毒核酸用特定的限制性内切酶酶切，通过对酶切的产物进行分析，从而区分被检病毒核酸。Kwon HM和Saif LJ等[22]对TGEV和PRCV核酸的差异性进行了分析，证明了在某些特定区域的碱基变化与该分离株的毒力强弱相关。Jackwood DJ和 Kwon HM[23]将TGEV的RT-PCR产物用限制性内切酶Sau3AI进行酶切，然后对S基因5′端的酶切图谱进行分析比较，得出的结论是该酶可将TGEV分成四个组，几种限制性内切酶联合使用，通过对酶切图谱的分析可以区分出TGEV的Purdue株和Miller株。

2.4.5 核酸探针技术

目前，己建立了用核酸探针杂交技术检测粪便样品、感染组织或感染细胞中的TGEV，用这些探针可区别不同TGEV毒株。曹三杰等[24]用PCR扩增制备TGEV的靶基因并进行纯化，经过系列参数的对比筛选，选择构建检测芯片的最适靶基因，进行基因芯片探针最佳标记方法试验，取得了较好效果。

2.4.6 原位杂交技术

原位杂交是在研究DNA分子复制原理的基础上发展起来的一种技术。原位杂交利用标记的已知核酸探针，在组织、细胞及染色体上检测特异的 DNA或RNA序列。原位杂交使用的核酸探针可以是放射性探针（如32P标记），也可以是非放射性探针（如地高辛标记）。Sirinarumitr T等[25]使用了含有TGEV S基因部分序列的两种质粒，成功检测了接种于细胞培养物上和自然感染病变肺脏组织中的TGEV和PRCV。

自1946年TGE发现并报道至今，猪传染性胃肠炎仍然在全世界各个国家和地区流行，给生猪养殖业造成了巨大经济损失。引起了国内外学者的广泛关注和研究，并得出了许多关于TGEV诊断技术的成果，越来越多的诊断技术应用于TGEV的诊断。在众多的诊断技术中，在诊断上具有各自方法的优点，但是在这些诊断技术中都有着其各自的局限性，因此要根据试验的目的要求，并结合具备的条件选择适宜的检测方法对猪传染性胃肠炎进行诊断。进一步开展TGEV诊断方法的研究是有必要的，实现诊断方法的便捷化、快速化和诊断试剂的商品化，同时，应将各种诊断方法有机结合起来，取长补短，以期达到最佳的检测结果，为及时和快速检测猪传染性胃肠炎，为本病的综合防治提供技术保障，以减少本病造成的经济损失，为我国养猪业的健康发展提供有力支持。

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贵州省2017年农业攻关项目资助(黔科合支撑[2017]2579号)

杨伟(1993-)，男，硕士研究生，主要从事动物传染病病原分子生物学的科研学习

*通讯作者：汤德元（1964-），男，教授，博士，硕士生导师，主要从事动物传染病病原分子生物学和中西兽医结合的教学科研工作。E-mail:tdyuan@163.com

2017-09-05）