突变特异性免疫组织化学法检测非小细胞肺癌EGFR基因突变

卢冠男 孙 宏

(吉林医药学院附属医院，吉林 吉林 132013)

突变特异性免疫组织化学法检测非小细胞肺癌EGFR基因突变

卢冠男 孙 宏

(吉林医药学院附属医院，吉林 吉林 132013)

目的探讨应用突变特异性免疫组织化学(IHC)法检测非小细胞肺癌(NSCLC)中表皮生长因子受体(EGFR)基因突变的临床使用价值。方法随机选取94例NSCLC患者，采用突变特异性IHC法和罗氏454下一代测序系统法进行检测EGFR基因突变状态，比较两种方法的特异性和灵敏度。结果EGFR基因突变阳性定位在肿瘤细胞质和细胞膜或细胞膜中。突变特异性IHC法检测NSCLC患者中EGFR基因突变阳性率为36.17%，其中腺癌的突变率为48.44%，鳞癌的突变率为10.00%，差异有统计学意义(Plt;0.05),罗氏454下一代测序系统法检测NSCLC患者中EGFR基因突变阳性率为38.30%，其中腺癌的突变率为51.56%，鳞癌的突变率为10.00%，差异有统计学意义(Plt;0.05)。突变特异性IHC法能够有效检测NSCLC EGFR基因突变，其结果与罗氏454下一代测序系统法具有极好的一致性(Plt;0.001)。结论突变特异性IHC法能够有效检测NSCLC EGFR基因突变,并且突变特异性IHC法能够与EGFR酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)治疗快速的反应，具有耗时短、易判读、检测费用少等特点。

免疫组织化学法；非小细胞肺癌；表皮生长因子受体基因；突变

治疗非小细胞肺癌(NSCLC)的方法主要是靶向治疗与化疗，表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)是主要的治疗晚期NSCLC的靶向药物〔1〕。研究表明，EGFR基因突变状态是决定TKIs疗效最重要的预测因子〔2〕。EGFR基因的突变主要发生在外显子18～21点上，其中外显子19的缺失突变(E746-A750)与外显子21点上的突变(L858R)所占的比例最大。目前，针对检测EGFR基因突变的方法有扩增阻滞突变系统、直接测序法、液相芯片法、数字PCR法等。罗氏454法是下一代测序法的代表性方法，它是一种高通量的测序方法，在临床中被广泛使用。本实验对患者同时采用突变特异性免疫组织化学(IHC)法和罗氏454下一代测序系统法进行检测EGFR基因突变状态，比较这两种方法的特异性和灵敏度。

1 资料与方法

1.1临床资料 选取吉林医学院附属医院自2015年2月至2016年12月确诊的94例NSCLC患者，其中手术切除肿瘤标本64例，纤维支气管镜、淋巴结穿刺、经皮肺穿刺等取得的活检标本30例。标本均由病理科医生鉴定肿瘤存在，并用4%的甲醛溶液固定，石蜡包埋组织。男53例，女41例，腺癌62例，鳞癌32例，年龄34～73(中位56)岁。患者均知情同意。

1.2突变特异性免疫组织化学法检测EGFR突变蛋白的表达 采用Labvision一步法二抗检测系统对EGFR突变蛋白表达的情况进行检测。由具有丰富经验的专家，采用双盲法对检测结果进行判断。

1.3DNA提取、PCR扩增和EGFR突变检测 按照codas DNA试剂盒的说明对样本进行制备，分光光度计对提取并重悬后DNA的含量进行测定，调整至所需浓度后加入到扩增的混合物中，EGFR基因外显子18、19、20、21由PCR扩增，并应用罗氏测序系统检对EGFR突变情况进行检测。

1.4统计学方法 应用SPSS11.0软件进行χ2检验。

2 结 果

突变特异性IHC法测得NSCLC患者，EGFR基因突变阳性率为36.17%(34/94)，其腺癌中为48.44%(31/64，E746-A750 15例，L858R 16例)，鳞癌中为10.00%(3/30，L858R 3例)，两者相比差异显著(Plt;0.05)。罗氏454 NGS系统法测得NSCLC患者EGFR基因突变阳性率为38.30%(36/94)，其腺癌中为51.56%(33/64，E746-A750 16例，L858R 17例)，鳞癌中为10.00%(3/30，L858R 3例)，两者差异显著(Plt;0.05)。突变特异性IHC测得NSCLC患者中突变阳性的1例罗氏454 NGS系统显示为阴性，3例罗氏454 NGS系统测得为阳性的病例，突变特异性IHC检测为阴性。两者具有极好的一致性。

3 讨 论

EGFR主要通过基因扩增、基因突变活化、蛋白质过表达等机制来诱导癌变。研究表明，肿瘤患者是否对EGFR-TKI敏感的强预测因子是EGFR突变，由此可见，检测EGFR突变是医生给予肿瘤药物的重要指标〔3〕。检测基因突变最直接的方法是直接测序法，目前临床上常采用这种方法，其优点是直观准确，它不仅能检测到突变还能够定位突变位置。但是直接测序法存在着很大的不足，比如费用高、时间长、操作过程复杂等〔4〕。近年来，随着高通量测序(NGS)技术的不断发展，传统的测序法受到了巨大的挑战，这种高通量测序技术的代表是罗氏454下一代测序系统法。454测序仪相对Sanger测和Solid测序具有价格适中和提供中等读长的优点。近年来国内外也有数篇关于IHC法检测E746-A750缺失突变及L858R突变的报道，但灵敏度波动范围较大，基于这种现状，急需一种能够可靠、容易、快速检测EGFR基因突变的方法，提高其检测的灵敏度，从而为临床使用EGFR-TKI提供依据〔5,6〕。目前，国外有文献报道，采用突变特异性IHC法检测NSCLC EGFR基因突变，其灵敏度同罗氏454NGS系统具有较好的一致性，但国内的报道较少〔7〕。本实验结果提示，突变特异性IHC法具有经济、简便、快速、易于推广等优势，与罗氏454测序具有较好的一致性。

1成志强,王晓玫,贺黎升,等.应用特异性突变抗体检测人非小细胞肺癌组织中EG-FR突变〔J〕.临床与实验病理学杂志,2014;30(5):531-4.

2陈顺平,苏海燕,吴文乔,等.非小细胞肺癌EGFR基因突变与扩增及蛋白表达的相关性分析〔J〕.临床与实验病理学杂志,2015；31(6):657-61.

3韩义明,郑 杰,姜云惠,等.非小细胞肺癌中EGFR基因突变与ERCC1、Ki-67表达及临床病理特征的关系〔J〕.临床与实验病理学杂志,2015；31(7):759-63.

4窦亚玲,祁晓莉,辛 论,等.TaqMan-扩增阻滞突变系统法检测非小细胞肺癌组织EGFR基因突变的价值〔J〕.中华医学杂志,2013;93(10):768-71.

5赵 静,赵金银,赵 肖,等.ARMS技术联合Taqman探针检测100例非小细胞肺癌EGFR基因突变〔J〕.中国肺癌杂志,2013;16(1):25-32.

6韩志刚,俞婷婷,申红丽,等.非小细胞肺癌中Napsin-A表达与EGFR基因的相关性研究〔J〕.实用临床医药杂志,2014;18(13):1-3.

7王理扬,黄媚娟,李 伦,等.非小细胞肺癌组织化疗前后表皮生长因子受体基因的突变〔J〕.肿瘤,2011;31(6):517-21.

〔2017-09-17修回〕

(编辑 袁左鸣/滕欣航)

R563.9

A

1005-9202(2017)22-5636-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.22.069

孙 宏(1964-)，女，主任医师，主要从事COPD矽肺、肺癌研究。

卢冠男(1982-)，女，硕士，主治医师，主要从事COPD睡眠呼吸病学研究。