小黄鱼鱼卵的形态学及遗传学鉴别

樊艳楠，叶振江，姜屹倩，万 荣，任一平，于洪亮

（1.中国海洋大学水产学院，山东青岛 266003；2.威海市文登区海洋与渔业局，山东威海 264400）

小黄鱼鱼卵的形态学及遗传学鉴别

樊艳楠1，叶振江1，姜屹倩1，万 荣1，任一平1，于洪亮2

（1.中国海洋大学水产学院，山东青岛 266003；2.威海市文登区海洋与渔业局，山东威海 264400）

为验证小黄鱼鱼卵形态学鉴别的准确性，以及CO I基因序列在小黄鱼鱼卵鉴别中应用的可行性，对黄海中南部近岸海域15个站位采集的两组平行样品分别进行传统形态学鉴别和CO I基因片段序列的测定。形态学鉴别结果显示，7站出现小黄鱼鱼卵，共计128粒。卵径1.242～1.535 mm，油球径0.414～0.567 mm。遗传学鉴别结果显示，共108个个体成功扩增并测序，共检测到17个单倍型，与小黄鱼间的遗传距离在0.000～0.038之间；与其他石首鱼科鱼类序列的遗传距离在0.112～0.317之间。Kimura双参数模型构建的NJ系统树聚类结果显示，鱼卵与小黄鱼单倍型聚为一支，与其他石首鱼科鱼类序列分为不同的分支，推断108粒鱼卵均为小黄鱼。对比形态学和遗传学鉴别结果，不存在显著差异（P=0.844>0.05）。结果表明，小黄鱼鱼卵的形态学鉴别具有较高的准确性，线粒体CO I基因可应用于小黄鱼鱼卵的鉴别。

小黄鱼鱼卵；CO I基因；遗传学鉴别；形态学鉴别

鱼卵的存活和数量是鱼类资源补充和渔业资源持续利用的基础[1]，因此，鱼卵种类组成与数量分布的研究，对揭示鱼类幼体栖息地选择、早期补充机制，以及制订渔业资源保护与可持续利用策略具有重要意义，而其相关研究依赖于鱼类鱼卵种类的准确鉴别。目前，国内外鱼卵种类鉴别的方法有传统形态学、卵膜扫描电镜观察、分子生物学和单克隆抗体免疫染色等[2]。传统上，一般采用形态学方法进行鱼卵种类鉴别[3]，然而由于相关种类形态学记述资料的不完备及其形态学发育过程的复杂性，鱼卵形态学鉴别具有较高难度和一定的不确定性。在此背景下，遗传学方法逐渐应用于海洋鱼类卵子的准确鉴别[4-5]，以及形态学鉴别的补充、校正，或形态学相似的近缘鱼种的数量比例估计[6-7]。HARADA等[8]利用鱼卵形态、CO I基因和16S rRNA基因鉴别鱼卵种类，以监测加利福尼亚南部海洋保护区的产卵活动。

在遗传学鉴别的各种方法中，mtDNA序列分析作为物种准确鉴别的有效方法之一[9]，已经广泛应用于鱼类鱼卵、仔稚鱼种类鉴别中[10-11]。其中CO I基因片段分子结构简单，进化速率适中，具有相对保守且足够的变异，是鉴别鱼类良好的分子标记[12-13]。柳淑芳等[13]研究结果证明CO I基因可作为DNA条形码对石首鱼科鱼类进行有效的物种鉴定；彭居俐等[14]研究表明以CO I基因作为鲌属鱼类DNA条形码进行物种鉴定具有一定的可行性。WARD等[16]通过对澳大利亚207种鱼类的CO I基因序列进行分析，得到鱼类CO I序列种内、属间和科间的平均遗传相似度分别为99.61%、90.07%和84.54%，进一步说明CO I基因序列可作为一种有效的分子标记用于物种鉴定。

小黄鱼Larimichthys polyactis是我国重要的海洋经济鱼种之一，在海洋渔业中的地位十分重要，其产卵场广泛分布于我国渤、黄、东海近岸海域，并与蓝点马鲛、棘头梅童鱼等的产卵场有较大的时空重叠[17]。小黄鱼鱼卵卵膜无特殊构造，卵径范围较大，与其他鱼卵种类存在一定混淆风险，尤其是发育早期的蓝点马鲛鱼卵[1,18-19]。目前，在我国应用遗传学方法对单个鱼卵进行种类鉴别的研究鲜有报道。本研究以黄海中南部近岸产卵场的鱼卵为研究对象，分别进行形态学鉴别和小黄鱼鱼卵的线粒体CO I基因测序，以验证CO I基因在鱼卵鉴别中的应用效果，及小黄鱼鱼卵形态学鉴别的准确性，为我国海洋鱼类早期生活史的研究提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 样品采集

2015年5月16日-23日期间，于黄海中南部（32°00′-35°32′N，119°45′-122°35′E）近岸海域，使用大型浮游生物网（网口内径0.8 m，网目0.505 mm，网衣长2.8 m）在船两侧同步采样。样品分别用5%福尔马林海水溶液和95%乙醇进行固定保存。网口设置水平流量计（HYDRO-BIOS）以记录滤水量。8尾小黄鱼成鱼采集于青岛近岸海域，取其肌肉组织浸于95%乙醇。

1.2 形态学鉴别

将5%福尔马林海水溶液固定的样品在室内进行分检，参照文献[17]和[20]，使用浮游生物计数板在江南永新JSZ5型体视显微镜下对鱼卵样品进行种类鉴别，随机挑选小黄鱼鱼卵约100粒进行观测并拍照。

1.3 遗传学鉴别

将95%乙醇固定的样品带回实验室进行分检，并在体视显微镜下挑选出小黄鱼疑似卵（卵径1.00～1.65 mm，且具有油球），分别编号，浸于95%乙醇。

1.3.1 DNA提取

鱼卵DNA提取采用Chelex-100（Bio-Rad Laboratories，US），利用吸管将鱼卵用95%乙醇吹打洗净放入离心管，用无菌牙签挑破，加入25 μL 6%Chelex-100及0.5 μL蛋白酶（20 mg/mL），参照文献[21-22]提取DNA。成鱼肌肉组织采用DNA试剂盒（TIANamp Genomic DNA Kit）提取DNA，置于-20℃保存。

1.3.2 扩增与测序

小黄鱼CO I基因片段的引物为：LP-F（5’-CATAACCCAATACCAAACACCCC-3’)，LP-R(5’-GAATCAATGAAAAAATCCACCCA-3’），由华大基因科技股份有限公司合成。

PCR反应体系为25 μL，其中2×Easy Taq Mix（北京全式金生物技术有限公司）12.5 μL，正反引物各1 μL（10 μmol/L），DNA模板2.5 μL，ddH2O 8 μL。热循环参数：94℃预变性3 min；94℃变性45 s，56℃退火45 s，72℃延伸1 min，35个循环；最后72℃延伸10 min。PCR产物送至华大基因科技股份有限公司由ABI PRISMTM 3730XL DNA Analyzer DNA测序仪进行测序。

1.4 数据处理与分析

1.4.1 数据处理

鱼卵分布密度以每100 m3水体中出现的个体数（ind/100 m3）表示。其公式[4]为：

式中，Nstd为鱼卵分布密度；N为实际捕获的鱼卵数量；w为滤水量。

1.4.2 序列分析

利用DNAstar中的Seqman软件对序列进行对比和校正，去除两端不可信序列。利用DnaSP 5.10软件[23]对校正后的测序结果进行单倍型统计分析。将单倍型输入GenBank中进行BLAST搜索，并下载石首鱼科鱼类的同源序列，利用MEGA 4.0软件基于Kimura 2-parameter[24]计算单倍型间的遗传距离，构建NJ系统树[25]，各分支的置信度采用Bootstrap（重复数为1 000）方法。

1.4.3 非参数检验

利用SPSS 18.0软件对两组平行样品的总鱼卵密度数据进行Wilcoxon符号秩检验，以确定所两组样品总鱼卵密度是否存在显著差异。若不存在显著差异，则认为采样误差可以忽略，可对两组小黄鱼鱼卵的形态学和遗传学鉴别结果进行Wilcoxon符号秩检验，以检验小黄鱼鱼卵形态学鉴别的准确性。

2 结果

2.1 形态学鉴别结果

共采集鱼卵1 278粒。其中，7站出现小黄鱼鱼卵，共计128粒。小黄鱼鱼卵为浮性卵，呈圆球形，卵膜光滑而透明，无特殊结构（图1）。卵径1.242～1.535 mm，主要为1.25～1.40 mm（图2）。卵黄均匀，无龟裂，呈米黄色。具橙黄色油球1个，油球径0.414～0.567 mm，原口关闭后，油球固定于胚体后部。当胚体围绕卵黄1/2周时，可在胚体头部及背部观察到点状黑色素（图1）。

图1 小黄鱼鱼卵Fig.1 L.polyactis eggs

图2 2015年5月黄海中南部近岸海域小黄鱼卵径Fig.2 The frequency distribution of diameter of the L.polyactis eggs collected at the central and southern Yellow sea in May 2015

2.2 遗传学鉴别结果

共采集鱼卵658粒，在体视显微镜下挑出小黄鱼疑似卵156粒。经PCR扩增、测序后，得到108条鱼卵的CO I基因片段序列。与8条成鱼的测序结果以及其他6种石首鱼科鱼类（表1）的CO I序列一同进行剪切、比对后得到548 bp的同源序列。

表1 基于CO I基因片段序列进行对比分析所用序列的信息Tab.1 Information of the partial sequences of CO I gene

108条鱼卵CO I序列中共检测到17个单倍型（EH1-EH17），单倍型多样性（Hd）为0.306 5，共30个变异位点。8条成鱼CO I序列共检测到5个单倍型（H1-H5），Hd为0.857 1，共7个变异位点。其中，90个鱼卵个体与3个小黄鱼个体共享单倍型EH1（H4）。将鱼卵的17个单倍型输入GenBank中进行BLAST搜索，结果显示鱼卵与小黄鱼序列的相似度均高于97%。采用Kimura双参数模型估算的鱼卵与小黄鱼个体间的遗传距离在0.000～0.038之间，平均遗传距离0.003；鱼卵与其他石首鱼科鱼类序列间的遗传距离在0.112～0.317之间（表2）。NJ系统树（图3，仅显示支持率大于50%的数据）显示，鱼卵与小黄鱼单倍型明显聚为一大支，与其他石首鱼科鱼类序列分为不同的分支。因此，推断鱼卵全部为小黄鱼。

图3 鱼卵和石首鱼科鱼类CO I基因单倍型NJ树Fig.3 The NJ tree for CO I gene haplotypes of fish eggs and the other species of Sciaenidae

2.3 形态学与遗传学鉴别结果对比分析

对两组平行样品的总鱼卵密度数据进行Wilcoxon符号秩检验，结果显示两组样品在鱼卵密度上不存在显著差异（P=0.084>0.05），如图4。因此，忽略采样的随机误差，可以对两组鱼卵样品的鉴别结果进行对比分析。结果显示，小黄鱼鱼卵的形态学与遗传学鉴别结果不存在显著差异（P=0.884> 0.05）。

图4 小黄鱼鱼卵分布密度Fig.4 The distribution densities of L.polyactis eggs

3 讨论

鱼卵传统形态学鉴别主要依据鱼卵的形态特征，采样地点、采样时间及采样海域习见鱼类种类等信息，但不同种鱼类可能具有相似的鱼卵形态学特征、重叠的产卵场及产卵期[26]。因此，运用形态学方法一般可将鱼卵鉴别到科或属的水平[27]，准确鉴别到种的水平存在一定困难。由于适用性等因素，目前传统形态学鉴别方法仍作为鉴别鱼卵的主要方法，mtDNA序列分析可作为一种辅助分类方法应用于鱼卵、仔稚鱼鉴别[28]。本试验分别以形态学和遗传学的方法，对两组平行样品进行鉴别。结果显示，两组小黄鱼鱼卵分布密度不存在显著差异，表明小黄鱼鱼卵的形态学鉴别具有相对较高的准确率，利用形态学方法鉴定小黄鱼鱼卵可靠性较高。

采用Chelex-100树脂法[21]提取单个鱼卵DNA，操作简单，整个提取过程均在一个离心管中进行，避免了损耗及二次污染，DNA提取效果良好，可应用于mtDNA基因PCR。以CO I基因片段为分子标记对鱼卵

进行遗传学鉴别，成功扩增出目的片段，表明遗传学方法可用于目标鱼卵的种类鉴别，与卞晓东等[12]研究结果一致。108粒鱼卵与小黄鱼的遗传距离为0.000～0.038，平均遗传距离为0.003，符合HEBERT等[28]所得出的大部分物种的种内遗传距离小于0.010的结论。Kimura双参数模型构建的NJ系统树聚类结果显示，鱼卵与小黄鱼单倍型聚为一支，亲缘关系极近，而与其他石首鱼科鱼类序列分为不同分支，亲缘关系较远。经遗传学综合分析推断108粒鱼卵个体全部为小黄鱼。研究结果表明，CO I基因序列在小黄鱼种内非常保守，种间具有一定的差异，可应用于小黄鱼鱼卵的鉴别，是一种可靠的鱼卵辅助鉴别手段。

表2 鱼卵与石首鱼科鱼类COI基因单倍型间的遗传距离Tab.2 Genetic distance between the haplotypes of fish eggs and the other species of Sciaenidae for CO I gene

小黄鱼鱼卵CO I基因单倍型多样性为0.306 5，与成鱼（Hd=0.857 1）相比多样性较低，推测主要由以下两个原因造成。其一，鱼卵不具备游泳能力，随波漂流。因此，同一批次的鱼卵相对较为集中。然而线粒体基因遵循母系遗传，因此同一雌性个体所产鱼卵的CO I基因单倍型相同。其二，存在较大的采样误差。小黄鱼鱼卵主要采自3个站位，其数量在采样站位间存在巨大差异。因此，不能够很好的代表调查海域小黄鱼鱼卵整体的遗传多样性。

致谢：感谢中国海洋大学水产学院孙世春教授为本研究提供了实验条件和指导。感谢武瑾、张晓英和居玉满同学在实验过程中所给予的帮助。

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Morphological and Genetic Identification of Larimichthys polyactis Eggs

FAN Yan-nan,YE Zhen-jiang,JIANG Yi-qian,et al
(College of Fisheries,Ocean University of China,Qingdao 266003,China)

In order to verify the correctness of morphological identification and identify if the partial sequences of mitochondrial CO I gene can be a useful tool to identify Larimichthys polyactis eggs,the eggs which were collected at 15 stations in the central and southern Yellow sea were identified by morphological and genetic method respectively.The results of morphological identification showed that 128 L.polyactis eggs were found at 7 stations,and the diameter ranges of eggs and oil droplets were 1.242-1.535 mm and 0.414-0.567 mm respectively.The genetic identification results showed that there were 108 sequences which were identified yielding 17 haplotypes.The Kimura 2-parameter distance between fish eggs and L.polyactis was 0.000-0.038; but the distance between eggs and the other species of Sciaenidae was 0.112-0.317.The neighbor-joining(NJ) tree indicated that haplotypes of eggs and L.polyactis were assembled at the same embranchment,but the eggs were assembled at different embranchments with the other Sciaenidae spp.Therefore,the 108 fish eggs were identified as L.polyactis.According to the non-parametric test,there is no significant difference between the results of morphological and genetic identification(P=0.844>0.05).The findings of this study clarified that the traditional identification of L.polyactis eggs is relatively accurate,and mitochondrial CO I gene can be used to identify L.polyactis eggs.

Larimichthys polyactis eggs;CO I gene;genetic identification;morphological identification

S917.4

A

1008－830X(2016)05－0366－06

2016-06-30

高等学校博士学科点专项科研基金项目（20120132130001）；中央高校基本科研业务费专项资金项目（201262004；201562030）

樊艳楠（1992-），女，山西临汾人，硕士研究生，研究方向：渔业资源.E-mail:452036094@qq.com

叶振江，副教授.E-mail:yechen@ouc.edu.cn