粮食中三种主要真菌毒素常用定量检测技术概述

□ 张新欣 长春市粮油卫生检验监测站

粮食中三种主要真菌毒素常用定量检测技术概述

□ 张新欣 长春市粮油卫生检验监测站

真菌毒素是粮食产品的重要污染物之一，黄曲霉毒素B1（AFB1）、玉米赤霉烯酮（ZEN）、呕吐毒素（DON）是污染最为普遍的三种毒素。本文对粮食产品中这三种真菌毒素检测技术研究进行系统阐述，对以后的检验工作提供了一些的可借鉴经验。

真菌毒素；粮食；定量检测技术；AFB1；ZEN；DON

真菌毒素是真菌产生的次生代谢产物，是粮食产品的主要污染源之一，对人类和动物都有严重危害。因此,对于霉菌毒素以及产毒霉菌的检测显得至关重要。黄曲霉毒素B1（AFB1）、玉米赤霉烯酮（ZEN）、呕吐毒素（DON）是污染最为普遍的三种毒素，在国家标准GB2761-2017中对各类粮食中的含量都有明确规定限量。

1 三种真菌毒素的危害[1-2]

黄曲霉毒素B1被世界卫生组织（WHO）的癌症研究机构划定为1类致癌物，是一种毒性极强的剧毒物质，其毒性是氰化钾的10倍，砒霜的68倍，慢性毒性可诱发癌变。黄曲霉毒素B1能够破环人和动物的肝脏组织，甚至引发肝癌和死亡。玉米赤霉烯酮有雌性激素的作用，可造成家禽和家畜的雌性激素水平提高，对动物的繁殖系统造成损伤，引发动物流产、死胎、畸胎甚至死亡等。急性中毒时，对心、肾、肝、肺和神经系统有一定的毒害作用，可以使神经系统亢奋，造成很多出血点，使动物突然死亡。呕吐毒素能引起人和动物呕吐、腹泻、皮肤刺激、拒食、神经紊乱、流产和死胎等，欧盟分类标准为三级致癌物。

2 三种真菌毒素的定量检测方法

2.1 前处理技术[3]

2.1.1 提取

从粮食中提取AFB1、ZEN及DON，固体粮食样品需要用粉碎机将其粉碎，过筛，再将样品和提取液混合后于超声波或涡旋振荡器或摇床中超声或振荡20 min，或快速搅拌3 min，震荡混匀后再过滤即可；液体样品则需用有机溶剂或有机提取液溶解，震荡混匀（方法同固体样品）后，静止或离心后过滤。

2.1.2 净化

不同检验方法对提取液净化程度要求不一，疫学方法特异性高，对样品净化程度要求相对较低，一般不需要复杂的净化过程，而薄层色谱法（TLC）以及高效液相色谱法（HPLC）对样品净化程度要求较高，所得提取液需进一步净化和富集，可以通过液液分离、固相萃取和免疫亲合柱等。一般玉米赤霉烯酮（ZEN）和呕吐毒素（DON）经过免疫亲和柱的淋洗和洗脱后即可，而复杂样品中的黄曲霉毒素B1（AFB1）经过免疫亲和柱后还需黄曲霉毒素专用型固相萃取净化柱（或功能相当的固相萃取柱）的进一步净化。

2.2 检测

现在检测三种真菌毒素的常用的定量分析方法有薄层色谱法（TLC）、高效液相色谱法（HPLC）、酶联免疫法（ELISA）以及胶体金检测技术。

2.2.1 薄层色谱法（TLC）[4-6]

薄层色谱法（TLC）是较早用来检验黄曲霉毒素B1（AFB1）、玉米赤霉烯酮（ZEN）和呕吐毒素（DON）的方法。样品经提取、浓缩和薄层分离后，在紫外光（波长365 nm）下产生蓝紫色荧光，根据其在薄层上显示荧光的最低检出量来测定含量。薄层板上黄曲霉毒素B1的最低检出量为0.0004 μg,检出限为 5 μg/kg。薄层板上脱氧雪腐镰刀菌烯醇的最低检出量为100 ng,检出限为300 μg/kg。因TLC法优点是适合于没有经过专门培训的人员操作，且成本低，无需价格昂贵的仪器，但目测半定量，检验结果易受主观因素影响，现在使用先进的荧光扫描技术进行定量分析，克服了定性半定量的缺点，但此方法所需试剂繁多、检测周期长、灵敏度偏低，使其应用受到一定限制。

2.2.2 高效液相色谱法（HPLC）[7-9]

高效液相色谱法（HPLC）是定量分析真菌毒素最常用的方法。试样中的呕吐毒素（DON）经提取净化后,用高效液相色谱-紫外检测器测定；试样中的玉米赤霉烯酮经提取净化后，用高效液相色谱荧光检测器测定；试样中的黄曲霉毒素B1经提取净化后可采用柱前衍生-液相色谱分离-荧光检测器检测，也可采用液相色谱分离-柱后衍生-荧光检测器检测。柱后衍生方法包括碘或溴试剂衍生、光化学衍生和电化学衍生等。该法的高分离效能、高检测效能、分析快速，为同时测定多种真菌毒素提供了条件。国标中检测谷物中三种真菌霉毒素检测限分别为黄曲霉毒素B1（AFB1）0.3 μg/kg，玉米赤霉烯酮（ZEN）5 μg/ kg，呕吐毒素（DON）100 μg/kg。此外高效液相色谱与质谱联用，能够大大提高分析的灵敏度和可靠性。但因设备昂贵、对样品中毒素纯度的要求较高，前处理复杂，导致检测成本高、周期长，无法满足大批量样品快速筛选的需要。

2.2.3 酶联免疫法（ELISA）[6,10]

酶联免疫法（ELISA）属于成熟的免疫学方法。试样经水提取、均质、涡旋和离心（或过滤）等前处理后，试样上清液或标准品中的真菌毒素与被酶标记的酶连偶合物，竞争性结合微孔中预包被的特异性抗体，洗涤后加入相应显色剂显色，经无机酸终止反应,450 nm或630 nm波长下检测，试样中真菌毒素与吸光度在一定浓度范围内呈反比。酶联免疫法（ELISA）具有灵敏、操作简便、样品前处理无需净化和样品处理量大等优点，适用于对大批量粮食产品中三种真菌毒素的筛查。但是按照我国现在国标规定，如果筛查结果为阳性，仍需用化学分析方法作进一步确认。

2.2.4 胶体金快速定量技术[10-11]

胶体金免疫层析技术是当今最快、灵敏和方便的免疫学检测技术之一，它将特异性的抗原或抗体以条带状固定在膜上，胶体金标记试剂（抗体或单克隆抗体）吸附在结合垫上。当待检样本加到试纸条一端的样本垫上后，通过毛细作用向前移动，溶解结合垫上，与胶体标记试剂后相互反应，移至固定的抗原或抗体的区域时，待检物与金标试剂的结合物与之发生特异性结合而被截留，聚集在检测带上，可通过肉眼观察到显色结果。胶体金快速定量技术具有检测时间短、灵敏度高、不用接触毒素标准品、有机试剂用量少和对环境及检验人员安全性最高等优点，适用于企业和质检机构对粮油农产品中真菌毒素进行现场筛查。

3 结语

粮食中的污染物很多，真菌毒素是其中重要的一种，在合适的环境下，它将迅速产生并威胁人类和动物的健康。这就需要科学完善的限量标准和更加先进的检测技术。除了以上常用的定量方法外，还有气相色谱、毛细管电泳和超临界液相色谱技术等可用来检测这三种真菌毒素，但由于各种原因在实际粮食检验中应用甚少。相信随着科研技术的发展,真菌毒素的检验方法会越来越多,越来越简便。

[1]吕波,孙国君,王兵兵,等.呕吐毒素对反刍动物的影响[J].草食家畜,2014.(1): 46-49.

[2]林怡,黎乐群,彭涛.黄曲霉毒素B1代谢及致肝癌机制的研究进展[J].中国现代医药杂志,2007. (12):131-133

[3]郭卫.粮油食品中真菌毒素的研究进展文[J].粮油加工,2010. (7):104-107.

[4]王照鹏 玉米赤霉烯酮检测方法研究进展[J]中国畜牧兽医2009,(5):216-218.

[5]马骏.ELISA和TLC检测饲料中AFB1含量的比较研究[J].畜牧与饲料科2013.(2):19-23.

[6]郑立新.浅谈黄曲霉毒素B1测定中应注意的问题[J].粮食加工,2004.(4):63-64.

[7] 国家卫生委和计生委,食品中黄曲霉素B族和G族的测定(GB 5009.22-2016),北京:中国国家标准委员会,2017.

[8] 国家卫生委和计生委,食品中玉米赤酶烯酮的测定(GB 5009.209-2016),北京:中国国家标准委员会,2017.

[9] 国家卫生委和计生委,食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的测定(GB 5009.111-2016),北京:中国国家标准委员会,2017.

[10]李小明 粮食中真菌毒素快速定量检测方法应用比较研究[J].粮油食品科技2017,(1):54-57.

[11]李康.胶体金免疫层析技术在真菌毒素快速检测中的应用[J].食品安全质量检测学报,2013.(1):201-204.

张新欣(1987-)，女，吉林长春人，本科，助理工程师。研究方向：粮油质量检验。