铜绿假单胞菌亚胺培南中介菌株oprD基因分析

孙庆惠， 杨白雪， 巴兆粉， 吴国营， 杨洪江

·论著·

铜绿假单胞菌亚胺培南中介菌株oprD基因分析

孙庆惠， 杨白雪， 巴兆粉， 吴国营， 杨洪江

目的分析铜绿假单胞菌临床分离株对亚胺培南耐药机制。方法采用VITEK32系统分析临床菌株耐药性；纸片协同法和纸片扩散法分析金属β内酰胺酶和AmpC β内酰胺酶活性；十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）方法分析临床菌株的外膜蛋白OprD的表达；PCR法扩增基因oprD并测序分析；随机扩增多态性DNA标记方法对临床菌株进行分型。结果7株菌确认为亚胺培南中介株，其中2株菌外膜通道蛋白OprD可能存在缺失，进一步分析发现其编码基因被插入序列ISRP10阻断。其余5株菌OprD蛋白大小存在差异，相应编码区大小为427～443个氨基酸，OprD蛋白二级结构转角区域L1-L8处均存在多种氨基酸替代或缺失。结论铜绿假单胞菌被插入序列ISRP10阻断失能，或其外膜蛋白基因oprD及OprD蛋白二级结构转角区域的氨基酸突变，导致临床分离株对亚胺培南呈中介。

铜绿假单胞菌； 亚胺培南中介； ISRP10； oprD基因

铜绿假单胞菌是常见的条件致病菌，可引起烧伤或免疫力低下患者感染，导致血流感染和泌尿系感染等疾病，在囊性纤维化肺炎（cystic fbrosis）患者中，铜绿假单胞菌感染能造成严重伤害甚至死亡[1]。

亚胺培南为碳青霉烯类抗生素，抗菌谱广、抗菌活性强，成为临床上治疗铜绿假单胞菌感染的常用抗菌药物[2]。然而，随着碳青霉烯类的广泛应用甚至不合理使用，导致临床分离菌株对亚胺培南的耐药率逐年增加[3-4]。

针对临床分离的9株铜绿假单胞菌，本研究对其进行了药敏分析，发现其中2株为亚胺培南敏感菌株，7株为亚胺培南中介菌株。进一步分析了铜绿假单胞菌外膜通道蛋白OprD的表达水平以及基因oprD的序列，确定临床分离菌株亚胺培南的耐药机制。

1 材料与方法

1.1 材料

9株临床铜绿假单胞菌分离于2009年9月－2010年10月天津市儿童医院住院患儿痰液标本，质控菌株铜绿假单胞菌ATCC27853（来自天津市儿童医院）和实验室菌株PAK[5]用于实验对照。

1.2 方法

1.2.1 药敏方法 采用法国 Bio-Mérieux公司的VITEK32系统检测临床分离铜绿假单胞菌对哌拉西林-他唑巴坦、头孢他啶、头孢吡肟、头孢曲松、亚胺培南、阿米卡星、庆大霉素、妥布霉素、环丙沙星、左氧氟沙星共10种抗菌药物的敏感性。结果判定采用2015年CLSI颁布标准。 采用纸片协同法和纸片扩散法检测金属β内酰胺酶和AmpC β内酰胺酶的活性[6-7]。

1.2.2 外膜蛋白OprD分析 OprD外膜蛋白的制备依据参考文献[8]。采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）法分析外膜蛋白，分离胶浓度为12 %，浓缩胶浓度为5 %。取外膜蛋白样品20 μL加入等体积2×上样缓冲液，100 ℃加热15 min使蛋白变性。经过上样、电泳、染色、脱色等步骤，在凝胶成像系统观察结果。

1.2.3 PCR扩增 oprD基因及序列分析使用primer primer 5软件设计扩增基因oprD引物，目的产物大小为1 412 bp（编码区为1 332 bp），上游引物oprD-F（5’ -CGCCGACAAGAAGAACTAGC-3’），下游引物oprD-R（5’-GTCGATTACAGGATCGACAG-3’）。PCR反应总体积为25 μL，扩增条件为95 ℃预变性10 min，95 ℃变性5 s、63.8 ℃退火1 min、72 ℃延伸2 min，共进行35个循环，72 ℃延伸10 min。在0.8 %琼脂糖凝胶上进行电泳，分析PCR产物。

对PCR产物进行测序，分别在假单胞菌基因组网站（www.pseudomonas.com）和NCBI网站（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）比对分析获得的序列。

1.2.4 随机扩增多态性DNA标记（randomly amplifed polymorphic DNA，RAPD）分型 按参考文献[9]提供的方法，进行RAPD分型。引物采 用OPB-07（5’ -GGTGACGCAG-3’） 和272（5’ -AGCGGGCCAA-3’）。扩增采用两步PCR方法，第1阶段包括94 ℃变性5 min、36 ℃退火5 min和72 ℃延伸5 min，进行4个循环；第2阶段包括94 ℃预变性1 min、94 ℃变性1 min、36 ℃退火1 min和72 ℃延伸2 min，进行35个循环。PCR产物在1.2 %的琼脂糖凝胶上进行电泳。采用软件GelQuest（http：//sequentix.de/gelquest/index.php）进行分析电泳结果，确定菌株之间的同源关系。

2 结果

2.1 细菌耐药性监测

9株铜绿假单胞菌的药敏试验结果见表1，其中2株对亚胺培南敏感，7株为中介菌株。检测9株临床菌株的金属β内酰胺酶和AmpC β内酰胺酶活性，均为阴性。

2.2 SDS-PAGE分析外膜通道蛋白OprD的表达

提取铜绿假单胞菌菌株的外膜蛋白，进行SDS-PAGE分析，外膜通道蛋白OprD相对分子质量大约为45 500[10]。根据蛋白质电泳中OprD蛋白的可能位置，初步将11株铜绿假单胞菌分为3个组。组I包括菌株PAK和ATCC27853，OprD蛋白大小一致；组Ⅱ包括亚胺培南敏感菌株TJ91和TJ169，其OprD蛋白大小与对照菌株相似；组Ⅲ为亚胺培南中介菌株，其中菌株TJ40和TJ180的OprD蛋白条带可能缺失，其余菌株的可能OprD蛋白，其条带大小存在差异（图1）。

2.3 PCR法分析oprD基因

为进一步确认SDS-PAGE的分析结果，扩增临床菌株的基因oprD，发现OprD蛋白缺失的菌株TJ40和TJ180的oprD基因大小为2.5 kb，比正常oprD基因多出1.1 kb，推测该基因可能存在插入突变；其余5株中介菌株的基因oprD扩增大小为1.4 kb左右，编码的蛋白质大小为427～443个氨基酸（图2）。

2.4 oprD基因的插入序列分析

将PCR产物测序，通过比对分析大小为2.5 kb的oprD基因序列，发现菌株TJ40和TJ180的oprD基因编码区均存在一个插入片段，大小均为1 116 bp，插入位点都位于503～504 bp。该插入序列与固氮斯假单胞菌（Pseudomonas stutzeri A1501） （GenBank Accession CP000304）基因组中的重复序列ISRP10的相似度为99 %。

表1 9株铜绿假单胞菌的药敏试验Table 1 Antibiotic susceptibility analysis of clinical strains of Pseudomonas aeruginosa

图1 SDS-PAGE分析临床菌株外膜蛋白Figure 1 Sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis showing outer membrane protein （OMP）profles of clinical strains of Pseudomonas aeruginosa

图2 PCR扩增临床菌株oprD基因Figure 2 PCR amplifcation of oprD gene from clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa

插入序列ISRP10的G+C含量为60.22 %，末端存在27 bp反向重复序列（IRs），该末端不是非常完美的反向重复，在反向重复序列中存在5个碱基不完全匹配。通过网站（http：//www.ncbi.nlm. nih.gov/gorf/gorf.html）进行分析，发现ISRP10存在1个342个氨基酸的读码框（ORF），编码假定转座酶（图3）。

2.5 正常大小oprD基因的序列分析

分别扩增菌株TJ84、TJ111、TJ141、TJ162和TJ176的oprD基因，测序后与PAO1的OprD蛋白氨基酸序列进行比对（图4）。菌株TJ84的oprD基因编码441 aa，在转角区域18个位置发生氨基酸替代或缺失，包括L1（S57E和S59R）、L4（E230K）、L5（ A267S）、L6（R310G）、L7（V360L，M373V，S374D，D375S， N376S，N377S，V378S，G379Y，Y380-，K381-，N382A，Y383G，G384L）。

菌株TJ111的oprD基因编码438 aa，在转角区域9个位置发生氨基酸替代，包括L2（T103S和K115T）、L3（F170L、E185Q、P186G、V189T）、L6（R310E）和L8（G425A，E431D）。

菌株TJ141的oprD基因编码427 aa，在转角区域21个位置发生氨基酸替代或缺失，包括L1（S57E和 S59R）、L4（E230K）、L5（N262T和 A267S）、L6（R310G）、L7（V360L，M373V，S374D，D375S，N376-，N377S，V378S，G379Y，Y380-，K381-，N382A，Y383G，G384L）和L8（N432-，N433-）。

图3 插入序列ISRP10 插入临床菌株的oprD基因（PAO1为参比菌株）Figure 3 Schematic representation of the oprD gene of clinical Pseudomonas aeruginosa isolates， which is disrupted by ISRP10 compared to reference strain PAO1

图 4 OprD蛋白氨基酸序列多重比对分析Figure 4 Multiple amino acid alignment （UPGMA） of OprD

菌株TJ162的oprD基因编码443 aa，在转角区域5个位置发生氨基酸替代，包括L3（F170L、E185Q、P186G、V189T）和L4（E230K）。

菌株TJ176的oprD基因编码441 aa，在转角区域23个位置发生氨基酸替代或缺失，包括L1（N52D，S57E和S59R）、L3（F170L、E185Q、P186G、V189T）、L4（E230K）、L5（ A267S）、L6（R310G）、L7（V360L，M373V，S374D，D375S， N376S，N377S，V378S，G379Y，Y380-，K381-，N382A，Y383G，G384L）。

2.6 RAPD分析

采用RAPD方法，对11株铜绿假单胞菌的分析结果如图5所示。采用随机引物OPB-07进行扩增分析，所有菌株的OprD可分为3个簇，进一步分为7个亚簇（图5A）；采用随机引物272进行扩增分析，可分为7个簇或亚簇（图5B）。结果显示，两条引物将11株铜绿假单胞菌分成不同的集合，它们的来源不是同一菌株，具有较显著的遗传多样性。

3 讨论

A， Profile generated by primer OPB-07； B， Profile generated by primer 272.图5 铜绿假单胞菌的RAPD分型Figure 5 Random amplifed polymorphic DNA （RAPD）analysis of the clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa

铜绿假单胞菌外膜蛋白OprD有多种突变方式，但关于大片段插入失活突变的报道不多。Wang等[11]曾发现4株菌由于大片段插入失活突变。2株菌的插入序列相同都为ISPa1328；另2株菌的插入序列分别为ISPre-like和 IS5，且这3种插入序列都属于IS5家族。Guzvinec等[12]曾报道，oprD基因翻译起始密码69 bp处插入ISRP10，导致该菌株对亚胺培南耐药。

本研究中，2株菌株是由于插入序列ISRP10而引起对亚胺培南中介。RP10首次于固氮斯假单胞菌中发现，在该基因组中重复3次[13]，且该序列与假单胞菌属 ZM2菌株中的插入序列 ISPsp7同源性为98 %，该插入序列属于IS30家族[14]。

OprD蛋白在细胞膜表面由16条肽链组成跨膜集束结构，膜外形成8个较长的环状结构，周质空间形成8个较短转角区域[15]。外膜蛋白OprD转角区域L1和L6与亚胺培南和OprD孔道打开无关，转角区域L2和L3与亚胺培南的结合相关，转角区域L4与孔蛋白的合成相关，转角区域L5、L7和L8收缩可使OprD通道打开，并且可防止非特异性的抗生素进入菌体[16-17]。

本研究中，菌株TJ111在外膜蛋白OprD转角区域发生的氨基酸替换，与Gutiérrez 等[17]的报道相同。菌株TJ111、TJ162和TJ176在转角区域L3发生的氨基酸替换，分别与颜英俊等[18]和Wang等[11]所报道的突变相同。因此，菌株TJ111、TJ162和TJ176可能由于OprD蛋白转角区域L2和L3发生的氨基酸替换或缺失，使外膜蛋白OprD的构象发生改变，从而导致对亚胺培南中介。菌株TJ84和TJ141在转角区域L4存在相同的氨基酸替换，同样可能导致OprD蛋白空间构象发生改变，从而引起菌株对亚胺培南中介。

有研究发现，蛋白OprD的转角区域L7中的12 个氨基酸残基 350- MSDNNVGYKNYG-361 被10个氨基酸残基350-VDSSSSYAGL-359取代，使其对美罗培南耐药，而对亚胺培南敏感[19]。本研究中，亚胺培南中介菌株中的3株，OprD在转角区域L7发生了突变，即373-MSDNNVGKNYG-384被373-VDSSSSY--AGI-384或373-VDS-SSY--AGI-384所取代。该突变是否会影响蛋白OprD的空间构象和功能，从而导致亚胺培南不能有效进入胞内，需要进一步确认。

[1] LISTER PD， WOLTER DJ， HANSON ND. Antibacterialresistant Pseudomonas aeruginosa： clinical impact and complex regulation of chromosomally encoded resistance mechanisms[J]. Clin Microbiol Rev， 2009， 22（4）： 582-610.

[2] PAPP-WALLACE KM， ENDIMIANI A， TARACILA MA，et al. Carbapenems： past， present， and future[J]. Antimicrob Agents Chemother， 2011， 55（11）： 4943-4960.

[3] LANDMAN D， BRATU S， KOCHAR S， et al. Evolution of antimicrobial resistance among Pseudomonas aeruginosa，Acinetobacter baumannii and Klebsiella pneumoniae in Brooklyn，NY[J]. J Antimicrob Chemother， 2007， 60（1）： 78-82.

[4] ROSENTHAL VD， BIJIE H， MAKI DG， et al. International nosocomial infection control consortium（INICC） report，data summary of 36 countries， for 2004-2009[J]. Am J Infect Control，2012，40（5）：396-407.

[5] BRADLEY TJ， KHAN NH. The production of extracellular lipids by Pseudomonas aeruginosa NCTC 2000 in stationary liquid media containing macrogols[J]. J Pharm Pharmac， 1974，26（11）： 900-902.

[6] YONG D， LEE K， YUM JH， et al. Imipenem-EDTA disk method for differentiation of metallo-β-lactamase-producing clinical isolates of Pseudomonas spp. and Acinetobacter spp.[J]. J Clin Microbiol， 2002， 40（10）： 3798-3801.

[7] KHARI FIM， KARUNAKARAN R， ROSLI R， et al. Genotypic and phenotypic detection of AmpC β-lactamases in Enterobacter spp. Isolated from a teaching hospital in Malaysia[J]. PLoS One，2016， 11（3）： 1-12.

[8] 张若文. 烧伤病房耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌耐药机制及分子流行病学研究[D] . 吉林大学：博士学位论文，2012 .

[9] MAHENTHIRALINGAM E， CAMPBELL ME， FOSTER J， et al. Random amplifed polymorphic DNA typing of Pseudomonas aeruginosa isolates recovered from patients with cystic fbrosis [J]. J Clin Microbiol，1996，34（5）：1129-1135.

[10] HUANG H， JEANTEUR D， PATTUS F， et al. Membrane topology and site-specifc mutagenesis of Pseudomonas aeruginosa porin OprD[J]. Mol Microbiol， 1995， 16（5）： 931-941.

[11] WANG J， ZHOU J， QU T， et al. Molecular epidemiology and mechanisms of carbapenem resistance in Pseudomonas aeruginosa isolates from Chinese hospitals[J]. Int J Antimicrob Agents， 2010， 35（5）： 486-491.

[12] GUZVINEC M， IZDEBSKI R， BUTIC I， et al. Sequence types 235， 111， and 132 predominate among multidrugresistant Pseudomonas aeruginosa clinical isolates in Croatia[J]. Antimicrob Agents Chemother， 2014， 58（10）： 6277-6283.

[13] YAN Y， YANG J， DOU Y， et al. Nitrogen fxation island and rhizosphere competence traits in the genome of root-associated Pseudomonas stutzeri A1501[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2008， 105（21）： 7564-7569.

[14] SZUPLEWSKA M， LUDWICZAK M，LYZWA K， et al. Mobility and generation of mosaic non-autonomous transposons by Tn3-derived inverted-repeat miniature elements （TIMEs）[J]. PLoS One，2014，9（8）：1-13.

[15] LI H， LUO YF， WILLIAMS BJ， et al. Structure and function of OprD protein in Pseudomonas aeruginosa： From antibiotic resistance to novel therapies[J]. Int J Med Microbiol，2012， 302（2）： 63-68.

[16] OCHS MM， BAINS M， HANCOCK REW. Role of putative loops 2 and 3 in imipenem passage through the specific porin OprD of Pseudomonas aeruginosa[J]. Antimicrob Agents Chemother，2000，44（7）：1983-1985.

[17] GUTIÉRREZ O， JUAN C， CERCENADO E， et al. Molecular epidemiology and mechanisms of carbapenem resistance in Pseudomonas aeruginosa isolates from Spanish hospitals[J]. Antimicrob Agents Chemother，2007，51（12）：4329-4335.

[18] 颜英俊，喻华，周忠，等. 亚胺培南耐药的铜绿假单胞菌中oprD基因突变研究[J]. 中华检验医学杂志，2009，32（4）：451-454 .

[19] EPP SF， KÖHLER T， PLÉSIAT P， et al. C-terminal region of Pseudomonas aeruginosaouter membrane porin OprD modulates susceptibility to meropenem[J]. Antimicrob Agents Chemother，2001，45（6）：1780-1787.

Analysis of oprD gene in imipenem-intermediate clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa

SUN Qinghui, YANG Baixue, BA Zhaofen, WU Guoying, YANG Hongjiang. （Key Laboratory of Industrial Microbiology, Ministry of Education, Tianjin Key Laboratory of Industrial Microbiology, College of Biotechnology, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China）

ObjectiveTo analyze the mechanism of imipenem resistance in Pseudomonas aeruginosa clinical isolates.MethodsAntibiotic resistance was analyzed using VITEK32 system. Metallo β-lactamase activity was determined by doubledisc synergy test. Amp C β-lactamase activity was determined by Kirby-Bauer disc method. OprD protein was analyzed by sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis. PCR was performed to amplify gene oprD. The amplified products were subject to sequencing analysis. The phylogenetic relationship was determined using random amplifed polymorphic DNA (RAPD) method.ResultsMembrane protein OprD was analyzed in 7 clinical isolates of imipenem-intermediate P. aeruginosa. Two strains were devoid of OprD proteins and the corresponding oprD genes were found disrupted by the insertion element ISRP10 in the coding regions. Five strains had OprD proteins with different sizes. Sequence analysis showed that the peptides ranged from 427 to 443 amino acids. Multiple amino acid substitutions and / or deletions were found within the Loop 1 through Loop 8 of the OprD secondary structures.ConclusionsISRP10 inactivation and amino acid substitutions in oprD gene confer imipenem resistance in the clinical isolates of P. aeruginosa.

Pseudomonas aeruginosa; imipenem intermediate; ISRP10; oprD gene

R378.991

A

1009-7708 （ 2017 ） 02-0177-05

10.16718/j.1009-7708.2017.02.011

2016-05-22

2016-07-29

国家自然科学基金（31370205，30970114）。

天津科技大学生物工程学院工业发酵微生物教育部重点实验室，天津 300457。

孙庆惠（1990－），女，硕士研究生，主要从事微生物与生化药学。

杨洪江， E-mail：hongjiangyang@tust.edu.cn。