RNA提取、定量及RT—PCR综合性实验在分子生物学检验技术教学中的实施

李江滨+巫媛+李育超+侯敢

摘 要 分子生物学检验技术是医学检验专业重要的专业课程，实验教学尤其是综合性实验的教学对学生综合技能的培养至关重要。本文从实验设计思路、 组织实施、 实施效果、 教学体会等方面阐述RNA提取、定量及RT-PCR综合性实验在分子生物学检验技术教学中的实施，并分析教学中存在的问题，提出相应的解决对策，为有关院校开设相关综合性实验教学提供参考。

关键词 RNA 综合性实验 分子生物学检验技术 教学

中图分类号：G424 文献标识码：A DOI：10.16400/j.cnki.kjdkx.2016.12.042

Abstract Molecular Biology Diagnostic Technique is an important professional course in laboratory Medicine. Experimental teaching， especially the teaching of comprehensive experiment is very important to the cultivation of students' comprehensive skills. This paper expound the teaching implementation of comprehensive experiment “extraction and quantification of RNA and RT-PCR” in molecular biology diagnostic technique from the experimental design ideas， organization， implementation， implementation effect， teaching experience and so on. Analyze the problems existing in the teaching， and put forward the corresponding countermeasures. Provide a reference of teaching on experiment of “extraction and quantification of RNA and RT-PCR” for some colleges.

Keywords RNA； comprehensive experiment； Molecular Biology Diagnostic Technique； teaching

1 实验设计思路

RNA提取、定量及RT-PCR综合性实验主要由RNA提取、RNA定量和RT-PCR这三个部分组成。在本校的实验设计中，目标基因采用常用 -actin基因片段。实验首先用TRizol试剂提取小鼠肝脏总RNA，然后用紫外分光光度法和琼脂糖凝胶电泳法检测所提取RNA的纯度和含量，最后利用引物oligo（dT）在逆转录酶作用下制备cDNA模板，通过小鼠 -actin基因的特异引物扩增出 -actin基因片段，并用琼脂糖凝胶电泳法检测扩增产物。实验内容涉及RNA的分离与纯化技术、紫外比色技术、凝胶电泳技术、RT-PCR技术等研究技术与方法，具有较好的实用性和先进性。

2 实验组织实施

RNA提取、定量及RT-PCR综合性实验所涵盖的知识面非常广，整个实验历时长，对学生的细心程度和实验技能要求较高，在实验过程中，有些试剂（比如TRizol试剂和氯仿）有强烈的刺激性气味且伴有毒性，而且任何一个环节的微小错误，都有可能导致实验最终失败，故实验需要在特殊环境下（如通风橱）进行。为了使学生在实验中能够学到更多的知识，并且顺利地完成实验，首先，学生应该在实验课前通过实验指导书和互联网了解实验的相关内容进行预习，熟悉实验的原理、仪器的使用方法、试剂的作用、操作步骤和注意事项，并与其他学生讨论预习过程中遇到的问题，若仍不能解决，则在老师讲解实验时边听边思考，务必在做实验之前弄懂实验的关键点和每个步骤的目的，尽量避免盲目操作和错误操作；其次，实验施教时，教师通过PPT展示和现场演示进行讲解，同时提出问题让学生回答，加深学生对实验要点的理解，并解答学生在预习过程中遇到的疑惑；再次，学生了解清楚每个步骤的操作、目的和注意事项后，开始进行实验，实验过程中，学生严格按照实验指导的说明来进行操作，在通风厨中进行加样，且要注意戴好口罩和手套，防止酶等因素影响实验，教师应督促和提醒学生是否有不当的操作，辅助学生完成实验；最后，教师对实验结果进行引导性的讲解，布置学生写实验报告，并要求学生在实验报告中结合实验原理对结果进行分析讨论，写明实验中的注意事项和实验要点，提出一些具有探究性的问题，以此启发学生的逻辑思维和创新思维，加深学生对实验的了解，并在一定程度上激发学生对分子生物学检验技术实验的兴趣。

3 实验实施效果

3.1 巩固理论知识，提高运用知识能力

由于分子生物学检验技术这门学科的理论知识较为抽象、复杂难懂，学生在预习实验的过程中，需要查阅书本、上网观看实验视频或者在网上查找资料以便更好地理解实验原理、操作步骤和注意事项，等等。同时，学生也对这个实验所涉及的知识点有了更好的掌握。学生在分析实验结果的过程中，复杂、抽象的理论知识转化成实物（比如凝胶电泳结果、测量吸光度的结果等等），可以帮助学生对课本中的知识点有更清晰的认识，这正是每个实验所要达到的目的。

3.2 提高独立解决问题的能力和自主学习能力

在学生预习实验的过程中，通過网络资源观看与此实验有关的Flash动画、视频，浏览一些图片和文字解说，或者是学生之间的交流，都有益于解答实验前的各种疑惑，这样既锻炼了学生在网络上查找资料的能力，同时也提高了学生独立解决问题的能力，而不会在实验课时依赖老师的讲解或者盲目地照着实验指导书做实验。

3.3 提高实验操作技能

分子生物学检验技术实验的特色之一就是微量，在此综合性实验中，加入氯仿离心后，需要在一个较为复杂的体系中吸取水相中的RNA，此过程伴有少许刺激性气味，再加上吸取的量非常少，很容易吸到有机相中的蛋白质或漂浮在液面上层的苯酚，因此，在这个步骤中，学生的实验操作技能可以得到很好的锻炼；另外，在逆转录制备cDNA和PCR扩增 -actin基因片段这两个步骤中，整个体系都是只有20 L，其中的模板、引物、酶、dNTP和缓冲液都不超过5 L，学生们加样时需要格外小心，比如加样之前观察枪头，预测所吸的溶液量是否达标，加样时全神贯注，片刻的分心都有可能导致实验失败，学生对于微量加样的操作能力可以在此过程中得到极大的提高。

3.4 增强主观能动性，提高兴趣

实验过程中，学生全程独立完成，从微量加样到启动离心机，从琼脂糖凝胶制备到启动电泳仪，教师只起到督促和提醒的作用，这样学生可以全身投入，积极性很快就被调动起来，并对这门学科产生浓厚的兴趣，在这种情况下，一个良好的综合性实验可能成为学生学习分子生物学检验技术的动力源泉和启蒙点。

3.5 增强团队意识

随着现代科技的飞速发展，科学研究越来越重视团队合作，单靠一个人的力量很难事事通晓、面面俱到，因此，教师应该有意识地培养学生与他人合作、交流、沟通的能力。在RNA提取、定量及RT-PCR综合性实验中，几乎每一步都牵涉到团队合作，比如为了高效率地进行实验，需要等齐所有同学才开启离心机、PCR扩增仪，还有，琼脂糖凝胶电泳过程中学生们的相互协作是实验成功的关键，因此，这个实验有效地提高了学生的团队意识。

4 教学体会

RNA提取、定量及RT-PCR综合性实验所涉及的知识面非常广，耗时较长，学生很难掌握每一个实验操作步骤和注意事项，也很难从始至终保持注意力的集中，笔者提出对此实验存在的问题及相应对策总结如下：

（1）学生上实验课前不预习的现象普遍存在，在实验过程中只是“照单抓药”机械性地操作，以致他们对实验原理、操作、结果等不理解。完全依赖教师在实验课上的讲解来学习实验是远远不够的，而且实验课的学时有限，教师的讲解只是起引导性的作用，需要学生通过查找资料等课前预习的方式才能学习得更加细致和深入。所以，应鼓励学生在课前通过课本和网络资源预习实验，必要时教师可以在课前对学生进行有关实验内容的提问，以提高学生课前预习的积极性。

（2）实验过程中有些学生因操作失误导致实验的误差过大甚至实验失败，比如在RNA提取过程中的微量加样和微量吸取，都是容易引起较大误差的操作，部分学生因操作失误使提取的RNA纯度过低；有些学生在制备cDNA和PCR扩增 -actin基因片段体系中漏加、多加试剂，导致 -actin基因片段扩增失败；还有些学生在琼脂糖凝胶电泳加样时戳破凝胶，或没有将样品准确加入梳孔中。这些失误多为学生操作不熟练或者没有经过课前的预习所致，教师在实验过程中除了做示范，引导学生之外，还应多鼓励学生，告诉他们不必紧张。有条件的实验室还可以在周末开放实验室，让学生吸取失败的教训之后第二次进行实验，弥补第一次实验的失误，同时也给学生一个练习操作的机会。

（3）实验课结束后，有部分学生对实验报告的态度不认真，只是照抄实验指导书的目的、原理、操作步骤，再加上实验结果，这样会大幅度降低了实验的预期效果，达不到完整的教学目的。对于这种情况，教师可以引导学生重视实验报告的讨论部分，比如，各个操作步骤的目的，实验的关键点和注意事项，对实验结果的分析，以及学生在实验过程中的体会等等。务必使学生将实验课中所遇到的问题与理论知识联系起来，解答问题并写在实验报告中，达到实验课和理论课相互辅助的目的。

（4）RNA提取、定量及RT-PCR综合性实验大约需要8个学时，在排课时有两种可行方案。第一，可以将此综合性实验分为两次完成，第一次在完成RNA定量后结束，将另一部分提取好的RNA置于-20 ℃保存，第二次实验时取出RNA继续完成RT-PCR部分。分两次课做完这个综合性实验。第二，课时安排允许的情况下，也可以在一天内，如上午加下午或下午加晚上，一次性完成此综合性实验，保证实验的连贯性，使同学们做实验时有更清晰的思路，更容易理解实验的前因后果。

*通讯作者：侯敢

基金项目：广东省高等教育教学改革项目“基于培养学生创新能力的分子診断学实验教学综合改革与实践”，广东省高等教育教学改革项目“医学检验技术专业实施班导师制的探索与实践”，广东省本科高校教学质量与教学改革工程项目、广东医科大学教学质量与教学改革工程建设项目“临床生物化学检验教学团队”。

参考文献

[1] 李江滨，林锦琼，李育超，等.“重组质粒的转化、提取及酶切分析”综合性实验在医学检验专业分子诊断学教学中的实施[J].教育教学论坛，2013.35：272-273.

[2] 褚玉新，王晓春.医学检验本科分子诊断学实验教学的探讨[J].湖南医科大学学报（社会科学版），2009.11（1）：245-246.

[3] 李江滨，谭荧飞，李育超.Western-blot综合性实验在分子诊断学教学中的实施[J].科技创新导报，2012（36）：142.

[4] 姚群峰，黄必胜，薛津若，等.医学检验专业分子诊断学理论与实验教学改革初探[J].湖北中医学院学报，2007.9（2）：6-7.

[5] 郝峰，郭素红，王皓，等.医学检验专业本科分子诊断学课程教学探讨[J].中国西部科技，2014.13（12）：66-71.