应用锁式探针结合斑点杂交技术检测甜瓜细菌性叶斑病

徐瑞，胡白石，田艳丽，黄艳宁，谢进，曹亮，彭斯文，朱校奇

（1湖南省农业生物资源利用研究所，长沙 410125；2南京农业大学植物保护学院，南京 210095）

应用锁式探针结合斑点杂交技术检测甜瓜细菌性叶斑病

徐瑞1，胡白石2，田艳丽2，黄艳宁1，谢进1，曹亮1，彭斯文1，朱校奇1

（1湖南省农业生物资源利用研究所，长沙 410125；2南京农业大学植物保护学院，南京 210095）

【目的】甜瓜细菌性叶斑病是危害甜瓜的重要种传细菌病害，是由丁香假单胞杆菌流泪病致病变种甜瓜菌株（Pseudomonas syringaepv.lachrymans）引起的。论文旨在建立高效、快捷、操作简单的检测技术以防止此病原菌传播。【方法】以GenBank公布的甜瓜细菌性叶斑病菌的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)基因序列为靶标，设计甜瓜细菌性叶斑病菌特异性锁式探针，建立锁式探针与斑点杂交技术结合的检测体系。以保存的目的菌株为材料，提取DNA作为模板进行锁式探针连接反应、酶切反应和扩增反应，并将锁式探针连接反应、酶切反应和扩增反应的反应温度和反应时间分别进行优化。利用优化的锁式探针连接反应、酶切反应和扩增反应分别对健康的甜瓜种子、带有甜瓜细菌性叶斑病的甜瓜种子、无菌水及25株其他参试菌株进行检测，测定该体系的特异性。将甜瓜细菌性叶斑病菌的DNA按10倍梯度稀释，依次稀释为1 ng·μL-1、100 pg·μL-1、10 pg·μL-1、1 pg·μL-1、100 fg·μL-1、10 fg·μL-1和1 fg·μL-1作为模板，利用优化的锁式探针连接反应、酶切反应和扩增反应，测定灵敏度。将探针与斑点杂交技术结合建立高通量检测体系，将上述反应过程中的扩增产物固定于尼龙膜上，将锁式探针上Zipcode序列的反向互补序列合成cZipcode（检测探针），检测探针（cZipcode）用地高辛标记后与产物进行杂交。……