广西不同产地三叶青中总黄酮含量分析

黎颖菁+付金娥+韦树根+潘丽梅

摘 要：【目的】 研究三叶青不同产地、不同生长年限和部位总黄酮含量，为广西三叶青的生产提供科学依据。【方法】采用紫外分光光度计法测定总黄酮含量。【结果】不同产地三叶青薯块中总黄酮含量存在着较大差异；三叶青薯块总黄酮含量随着生长年限的增长而不断上升；不同部位之间总黄酮含量差异显著，以薯块的总黄酮含量最高。【结论】评价出广西三叶青生产的最佳产地及采收方法与部位。

关键词：三叶青 总黄酮

三叶青（Tetrastigma hemsleyanum），为葡萄科崖爬藤属植物，其块根称为蛇附子。异名：有角乌蔹莓、石老鼠、石猴子、石抱子、搜夹风、三叶扁藤、丝线吊金钟、金丝吊葫芦、金线吊马铃薯等[1]。三叶青主要分布在长江以南地区，生于阴湿山坡、山沟或溪谷旁林下，以块根或全草入药，为民间常用的中草药，具有抗癌抗肿瘤[2-3]、抗炎、镇痛与解热[4]、保肝[5-6]等作用，且毒副作用小，是西药无法代替的“植物抗生素”。临床上已广泛用于抗癌及抗艾滋病毒、抗肿瘤等疾病。近年来，我国有多个中药厂都在使用三叶青作原料生产中成药，如三叶青胶囊、三叶青冲剂、三叶青茶等并且其需求量呈大幅度增长趋势，市场的需求引起人们对三叶青研究的日益重视。本研究以来源于广西乐业县、田林县、西林县等的9份种质资源为试验材料，研究了三叶青不同产地及不同生长年限和部位总黄酮含量，研究结果将为三叶青的生产提供科学依据。【前人研究进展】目前对三叶青的研究主要集中在化学成分、药理、临床等方面，而在资源、栽培等方面的研究则相对较少。韦树根等对广西三叶青的资源状况进行了调查研究，发现广西三叶青的野生资源已濒临灭绝[7]；程良绥介绍了三叶青的生物学特性，并从选地与整地、育苗、种植、林地管理、病虫害防治、采收等方面总结三叶青林下栽培技术[8]；吉庆勇等观察了三叶青形态特征和生长发育特性[9]；钱丽华等以三叶青叶片诱导的愈伤组织为试材，接种继代增殖，进行不同温度和光周期培养试验[10]；总黄酮含量测定研究方面，吉庆勇等采用紫外可见分光光度法测定了人工种植和野生三叶青中黄酮的含量，分析结果表明，两者含量没有显著差异[11]；范世明等也是采用紫外分光光度法对福建不同产地三叶青的总黄酮含量进行了测定[12]。【本研究切入点】广西是三叶青的主要产区之一， 但目前为止未见有对广西不同产地、不同生长年限及不同部位总黄酮含量比较的研究。因此本研究主要对广西主产区的三叶青种质资源进行总黄酮含量比较研究，同时测定三叶青不同生长年限和不同部位的总黄酮含量，旨在為广西三叶青资源的开发提供科学的依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

以采集于广西西林、田林、隆林、乐业、凌云、宜州、环江、罗城、马山等县的9份三叶青（Tetrastigma hemsleyanum）的种质资源试验材料。

1.2 仪器与试剂

Cary 50型可见-紫外分光光度计，美国Varian公司；MARS-5型高压微波消解仪，美国 CEM公司；CP224S型电子天平，德国Sartorius公司；CP225D型电子天平，德国Sartorius公司；芦丁，中国药品生物制品检定所，亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、乙醇均为分析纯，国药集团化学制剂有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 供试品的制备

精密称取不同产地、不同年份、不同部位的供试品0.5 g（精确至0.001 g）于100 mL三角瓶中，分别加入60 %乙醇溶液25 mL，在85 ℃恒温水浴锅上加热回流提取2 h，取出冷却，过滤，用60 %酒精反复清洗残渣，滤液转移到50 mL容量瓶中，加60 %乙醇稀释至刻度，摇匀即得。

1.3.2 标准溶液的制备

精密称取芦丁标准品5 mg（精确至0.0001 g），放入烧杯中，加入乙醇适量，置于水浴锅上微热使其溶解，放冷，转移至25 mL容量瓶，用60 %乙醇定容至刻度，摇匀，其得到的芦丁标准溶液的浓度为0.2 mg/mL。

1.3.3 测定波长的选择

取一定量1.2.2和1.2.3项下制备的供试液和标准品溶液，置于25 mL容量瓶中，各加50 %乙醇溶液至6 mL，加5 %亚硝酸钠1 mL，摇匀，放置6 min，加入10 %硝酸铝1 mL，摇匀，静放6 min，再加10 %氢氧化钠10 mL，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，放置15 min于200～800 nm波长区间扫描吸收曲线，供试品溶液在500 nm处有最大吸收，与芦丁标准品溶液吸收曲线相似，故选用500 nm为测定波长。

1.3.4 标准溶液的制备

精密量取0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL芦丁标准溶液，分别置于25 mL容量瓶中，按‘1.3.3中方法操作制备，于500 nm处测定其吸光度（X）， 以试剂空白调零。以吸光度（X）为横坐标，质量浓度（Y）为纵坐标绘制标准曲线。

1.3.5 方法精密度

取0.2 mg/mL的芦丁标准溶液2.0 mL，置于25 mL容量瓶中，按‘1.3.3中方法操作制备，于500 nm处连续测定其吸光度7次，计算7次吸光度的平均值和相对标准偏差。

1.3.6 重复性实验

将田林产三叶青（块根）供试品分成等量的7份，进行平行实验。按照“1.3.3”中方法制备样品，测定其吸光度，利用回归方程计算7份三叶青样品中游离氨基酸含量，并计算7次游离氨基酸的平均值和相对标准偏差。

1.3.7 稳定性实验

精密量取田林产三叶青供试液2.0 mL置于25 mL容量瓶中，按照“1.3.3”中方法制备样品，每隔20、40、60、80、100、120 min测定其吸光值。

1.3.8 样品的测定

精密量取适量的供试液（三叶青茎、叶提取液各5 mL，块根提取液各2 mL），分别置于25 mL容量瓶中，按照“1.3.3”中方法制备样品，于500 nm处测定其吸光度。

2 结果与分析

2.1 标准曲线及线性关系

由图1，芦丁在8～48 μg/mL与吸光度呈良好的线性关系。回归方程为Y=0.0668X-0.0003，R2=0.9999。

2.2 方法精密度

从表1可知，7次芦丁标准溶液的吸光度的变化幅度不大，其RSD为0.36 %，说明该方法的精密度良好。

2.3 方法的重复性

从表2可知，7次测定田林产三叶青中总黄酮的含量变化不大，其RSD为0.76 %，说明实验方法的重复性良好。

2.4 供试液的稳定性

从表3可知，样品溶液在1.5 h内的吸光度变化不大，其RSD为0.68 %，说明供试样品溶液在1.5 h内稳定。

2.5 不同产地总黄酮含量比较

2010年10月，把收集到的种质资源种植于种质圃内，进行统一管理。2013年2月每一种质采挖10株，每株采挖3个薯块，混合晒干后测定各种质总黄酮含量。各种质的总黄酮含量见表4。从表4可以看出，不同产地三叶青的总黄酮含量存在着较大差异。百色地区其中总黄酮含量较高，最高是来源于田林县，其含量为4.79 %；含量最低的来源于环江县为2.89 %，最高含量是最低含量的1.66倍。

2.6 不同生长年限

以来源于广西乐业县的种质为材料，在植株生长的不同时期采其薯块测定总黄酮的含量，总黄酮的含量的动态变化如图2。根据图2可以看出，三叶青块茎总黄酮含量随着生长年限的增长而不断上升，總黄酮累积速度最快的是第1年、第2年，第3年以后总黄酮累积速度开始变慢，四年生薯块总黄酮含量分别是一年生、二年生、三年生的2.32、1.35、1.08倍。

2.7 不同部位总黄酮含量

以广西乐业县3年生三叶青为研究材料，采收同一单株上的叶片、藤茎、块茎晒干至恒重，分别测定其总黄酮含量，结果见表5。从表5可以看出，同一植株上不同的部位其总黄酮含量差异显著。以块茎的总黄酮含量最高，藤茎次之，叶片的最低。块茎总黄酮的含量分别是藤茎和叶片的8.38和5.65倍。

3 讨论

研究结果表明，在9份三叶青种质资源中，不同种质之间薯块的总黄酮含量有较大的差异，来源于百色地区的田林县、乐业县、凌云县的种质资源总黄酮含量总体上比来源于河池地区的宜州市、环江县、罗城县的总黄酮含量高。其中总黄酮含量最高是来源于田林县，其总黄酮含量为4.79 %；含量最低的来源于环江县，其总黄酮含量为2.89 %，最高含量是最低含量的1.66倍。范世明等对福建不同产地三叶青的总黄酮含量进行了测定，但其测定主要是福建和浙江地区的样品，其研究结果表明各个产地的三叶青根总黄酮含量存在明显差异，与本研究结果一致[7]。说明三叶青总黄酮的变异幅度较大，在遗传育种上有较大的潜力，通过种质资源的评价及优良品种的选育可选育出适合于生产的优良品种。三叶青块茎总黄酮含量随着生长年限的增长而不断上升，但第3年至第4年的增长幅度较小，因此在生产上如产量达到要求，三年生的三叶青即可采收。此外，本文还对三叶青的不同部位进行了研究，发现藤茎和叶片总黄酮含量也较高，但块茎的总黄酮含量显著高于藤茎和叶片。不同生长年限和不同部位的总黄酮含量的研究，可为三叶青的采收提供科学的依据。

参考文献

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