梯度稀释法结合气相色谱-嗅闻-质谱联用仪鉴定炸花椒油中关键性香气活性化合物

陈海涛,孙丰义,王丹,孙宝国,2,3,张玉玉,2,3

1(北京工商大学 北京食品营养与人类健康高精尖创新中心,北京,100048) 2(北京工商大学 北京市食品风味化学重点实验室, 北京,100048) 3(北京工商大学 食品质量与安全北京实验室,北京,100048)

梯度稀释法结合气相色谱-嗅闻-质谱联用仪鉴定炸花椒油中关键性香气活性化合物

陈海涛1,2,3*,孙丰义1,王丹1,孙宝国1,2,3,张玉玉1,2,3

1(北京工商大学 北京食品营养与人类健康高精尖创新中心,北京,100048) 2(北京工商大学 北京市食品风味化学重点实验室, 北京,100048) 3(北京工商大学 食品质量与安全北京实验室,北京,100048)

采用同时蒸馏萃取和溶剂辅助蒸发提取炸花椒油中的挥发性风味成分，气相色谱-质谱联用(gas chromatography-mass spectrometry ,GC-MS)对提取物进行定性和定量分析，梯度稀释法结合气相色谱-嗅闻(gas chromatography and olfactometry ,GC-O)鉴定提取物中的关键性香气化合物。2种方法共鉴定出75种挥发性风味成分，包括烃类19种、醛类13种、醇类22种、酮类5种、酯类8种、杂环类及其他化合物8种；2种方法共检测出58个气味活性区域，从中鉴定出44种香气活性化合物，稀释因子较大(FD≥34)的芳樟醇、大根香叶烯D、柠檬烯、乙酸芳樟酯、乙酸-4-松油烯醇酯等是炸花椒油中的关键性香气活性化合物。

炸花椒油；同时蒸馏萃取；溶剂辅助风味蒸发；梯度稀释法

花椒在我国作为香辛料使用历史悠久，位列调料“十三香”之首[1]，在我国传统烹饪中能起到去腥、提香、增味的作用。目前，我国的花椒油、花椒调味油品质参差不齐，加工技术水平相对低下[2]。国外对于花椒的香气成分研究相对较少，国内主要研究生花椒以及冷榨花椒油，而对于炸花椒油的风味研究较少。WANG等[3]采用超声雾化萃取与顶空单液滴萃取相结合的方法快速检测分析花椒中的挥发油成分，MIZUTANI等[4]检测分析了花椒中的6种酰胺类的化合物，牛欣欣等[5]以羟基-α-山椒素提取率为响应值优化了花椒油的浸提工艺，王芳等[6]优化了油浸法提取花椒中风味物质的工艺条件。与普通花椒油相比，炸花椒油的风味透发性更强，咸香风味更浓郁。因此，对炸花椒油中的关键性香气活性化合物的确定，对其加香产品的生产起到至关重要的作用。

同时蒸馏萃取(simultaneous distillation and extraction，SDE)将水蒸汽蒸馏与溶剂萃取合二为一，有利于较高分子质量的挥发性风味物质的提取，但样品的加热温度较高[7]，会破坏样品原有的风味；溶剂辅助风味蒸发(solvent-assisted flavor evaporation，SAFE)是一种能有效地把挥发性成分从复杂基质中提取出来的方法，在低温、高真空条件下进行蒸馏、馏出液通过液氮冷冻收集，对样品中的热敏性挥发性成分损失少，萃取物能够保持样品原有的自然风味，但萃取需要溶剂且仪器清洗比较困难[8]。

AEDA(aroma extract dilution analysis)可以将萃取得到的浓缩提取物进行梯度稀释，直到在嗅闻口闻不到气味为止，此时的稀释浓度比值即为该化合物的FD因子，该方法能够通过人机的有效结合来实现气味化合物关键程度的分级[9]。

本实验采用同时蒸馏萃取和溶剂辅助风味蒸发2种方法提取炸花椒油中的挥发性风味成分，应用梯度稀释法结合气相色谱-嗅闻-质谱联用仪鉴定出炸花椒油中的关键性气味活性成分。

1 材料与方法

1.1 原料、试剂与仪器

四川金阳红花椒、元宝牌豆油，市售；二氯甲烷、正戊烷、无水Na2SO4，AR，国药集团化学试剂有限公司；C6～ C30的正构烷烃，质量分数≥99.0%，美国Sigma-Aldrich公司；邻二氯苯，色谱级，99%，Aladdin公司；氮气，体积分数99.9%，北京氦普北分气体工业有限公司。

同时蒸馏萃取装置(定制加工)、溶剂辅助挥发性香气蒸发装置(定制加工)，莘县京兴玻璃器皿有限公司；TRACE 1310气相色谱-质谱联用仪，美国Thermo公司。

1.2 实验方法

称取300 g豆油和100 g花椒常温混合置于锅中，电磁炉加热，功率800 W，油炸过程中不断搅拌，待温度达到170 ℃时停止加热，立刻将花椒沥出，单独盛取炸花椒油，冷却至室温后冷藏待用。

1.2.1 SAFE法提取炸花椒油挥发性风味成分

将V(炸花椒油)∶V(二氯甲烷)=1∶4混合后置于SAFE装置的滴液漏斗中，水浴和超级恒温水槽的温度均设定为50 ℃，在2个冷阱中加入液氮，待系统的真空度达到10-7MPa时，缓慢打开滴液漏斗旋塞，控制样品液的流速，萃取约20 min。在相同条件下做3组平行实验。将所得3个平行萃取液分别加入无水Na2SO4置于冰箱(-18 ℃)中干燥约12 h后，过滤得到澄清萃取液，旋转蒸发至3～5 mL，氮吹至1 mL，密封置于冰箱中冷冻保存，待气质联机分析。

1.2.2 SDE法提取炸花椒油挥发性风味成分

称取100 g炸花椒油于1 000 mL的圆底烧瓶中，再添加200 mL的去离子水，量取50 mL的正戊烷于100 mL的圆底烧瓶中。1 000 mL的圆底烧瓶放入130 ℃的油浴锅中恒温加热，50 mL的圆底烧瓶放入45 ℃的水浴锅中恒温加热，同时蒸馏4 h。在相同条件下做3组平行实验。将所得3组萃取液分别加入无水Na2SO4置于冰箱(-18 ℃)中干燥约12 h后，过滤得到澄清萃取液，旋转蒸发至3～5 mL，氮吹至1 mL，密封置于冰箱中冷冻保存，待气质联机分析。

1.2.3 AEDA方法

将SAFE法(SDE法)提取的样品，用二氯甲烷(正戊烷)按体积比1∶3、1∶9、1∶27等逐级稀释，直到评价员在嗅闻口闻不到气味为止，每种香气化合物的最高稀释倍数规定为其FD因子。

1.2.4 GC-MS-O检测条件

气相条件：TG-WAX毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；进样口温度250 ℃；升温程序：起始温度40 ℃，保持1 min，以10 ℃/min升温至60 ℃，以2 ℃/min升温至68 ℃，保持1 min，以6 ℃/min升温至106 ℃，以4 ℃/min升温至128 ℃，以6 ℃/min升温至220 ℃，保持3 min；载气(He)流速1.0 mL/min；进样量1.0 μL；分流比50∶1(嗅闻不分流)。

质谱条件：电子轰击(EI)离子源；电子能量70 eV；离子源温度280 ℃；传输线温度250 ℃；质量扫描范围35～500 amu。全扫描方式扫描；溶剂延迟5 min；调谐文件为标准调谐。

嗅闻条件：接口温度250 ℃；嗅闻过程中为防止评价员鼻腔干燥通入湿润的空气；共3位评价员记录嗅闻到的气味时间、强度以及气味特性。

1.3 数据处理

定性分析：以NIST14谱库检索结合保留指数进行定性。

保留指数(I)以C6～C30正构烷烃为内标物，根据(1)式进行计算：

(1)

式中：t′(i),待测组分的调整保留时间(min)[t′(n)

定量分析：内标法进行定量，以邻二氯苯为内标物，用二氯甲烷稀释到1 300 μg/mL。

待测组分在炸花椒油中的含量X根据(2)式进行计算：

(2)

式中：X，待测组分在炸花椒油中的含量,μg/g；f：相对校正因子；Ai：待测组分的峰面积；Ao：内标物的峰面积；Co：内标物的浓度,μg/mL；Vo：内标物的体积, mL；Vi：待加内标的萃取液的体积,mL；V：萃取液氮吹后的体积,mL；m，前处理样品的质量,g。

2 结果与讨论

2.1 炸花椒油挥发性风味成分GC-MS分析

通过SDE法和SAFE法提取炸花椒油挥发性风味成分，所得结果见表1。

由表1可知，通过SDE和SAFE2种方法结合GC-MS提取分析炸花椒油挥发性风味成分，共鉴定出75种挥发性风味化合物，其中烃类19种、醛类13种、醇类22种、酮类5种、酯类8种、杂环类及其它化合物8种。SDE法共鉴定出67种香气化合物，SAFE法共鉴定出41种香气化合物，2种方法共同提取并鉴定出33种香气化合物。SDE法比SAFE法鉴定出的香气化合物的数量多，可能的原因有2个，一是2种方法所用溶剂不同，根据溶剂的相似相溶原理选择地提取化合物，之所以2种方法选取不同的溶剂，是经过条件优化之后，选取的最佳条件；二是2种方法的原理不同，SDE法是将长时间的高温蒸煮产生的挥发性香气化合物连续性的提取出来，而SAFE法是将样品中的化合物在较低温度下短时间内提取出来。尽管SAFE法提取出的香气化合物数量较少，但其鉴定出了一些SDE法并未检出的化合物，起到了相互补充的效果。例如，SDE法鉴定出2种酮类化合物，而SAFE法鉴定出另外3种不同的酮类化合物。

烃类化合物共鉴定出19种，所占相对含量的比例最大。其中，SDE法鉴定出19种，SAFE法鉴定出14种，由此可以看出，SDE法更适合炸花椒油中烃类化合物的提取。烃类中相对含量较多的化合物包括柠檬烯、月桂烯、桧烯、β-水芹烯、反式-β-罗勒烯、γ-萜品烯、α-萜品烯，柠檬烯在花椒挥发油中的所占比例较大，其与芳樟醇的含量在一定程度上反映了花椒的品质和差异[10]。鉴定出的烃类化合物主要提供炸花椒油的青香和辛香，在花椒以及花椒副产品中是主要的呈香化合物。

表1 炸花椒油挥发性风味成分GC-MS鉴定结果

续表1

注：含量(μg/g)=平均值±相对标准偏差；定性方法中，MS为质谱定性，RI为保留指数定性；保留指数的文献值来源于NIST14谱库中的参考文献。

醛类化合物共鉴定出13种，相对含量较少。SAFE法仅萃取出6种醛类化合物，与SDE法相比，该法并不适用于提取炸花椒油中的醛类化合物。醛类物质具有较低的阈值，所以尽管其相对含量较低，但其对炸花椒油香气的贡献不可忽视。醛类化合物能够提供青草香和木香，使香气更接近植物性香气[11]。2种方法共同提取出的枯茗醛具有青香、辛香、肉桂样香气以及小茴香味道[12]。

醇类化合物共鉴定出22种，2种方法共同提取并鉴定出的化合物有5种。SDE法对芳樟醇、4-萜烯醇、α-松油醇的提取率明显高于SAFE法。芳樟醇具有催眠、抗抑郁、抗氧化以及抗衰老等作用[13]，并伴有清甜的花香和木香，在调香中应用十分广泛。SAFE法提取出较多的反式-4-侧柏醇，该化合物在许多文献[14-16]中都有报导，所以，其应是炸花椒油中不可或缺的香气成分。

酯类化合物共鉴定出8种，SDE法鉴定出7种香气化合物，SAFE法仅鉴定出4种香气化合物。2种方法均检测到化合物中相对含量最高的是乙酸芳樟酯，乙酸芳樟酯的含量与柠檬烯的含量相当，其能够提供花香与柠檬烯强度较大的柠檬果香相协调。乙酸冰片酯具有木香、樟脑和薄荷香气。

酮类化合物共鉴定出5种，SDE法鉴定出2种，1-(1,4-二甲基-3-环己烯-1-基)乙酮和胡椒酮。SAFE法鉴定出3种，香芹酮、薄荷酮和吡喃酮。香芹酮和薄荷酮是留兰香精油的主要化学成分，其具有清新、凉爽和香甜的气味[17]。吡喃酮是吡喃的酮类衍生物，α-吡喃酮又名香豆灵，有干草气味。

杂环及其它类化合物共鉴定出8种，SDE法鉴定出8种，SAFE法鉴定出5种。桉树脑在2种方法中均有检出，且相对含量最高，有类似樟脑的气味，普遍存在于桉树油、玉树油、樟脑油以及月桂叶油中，广泛应用于医药行业，也用作牙膏的香精原料。

2.2 炸花椒油挥发性风味成分GC-O分析

采用SDE/GC-O与SAFE/GC-O分析炸花椒油的香气活性化合物所得结果见表2。

表2 炸花椒油SDE提取与SAFE提取的GC-O分析结果

续表2

注：定性方法中，MS为质谱定性，RI为保留指数定性，“-”未检出。

由表2可知，尽管GC-MS鉴定出75种挥发性化合物，但是经GC-O分析只有58个气味活性区域，由此可见，并不是所有鉴定出的化合物都对炸花椒油的香气有贡献。经GC-O鉴定出的化合物香气类型包括水果清甜香、烤香、脂肪香、木香、花香、霉味以及清凉味等。通过质谱与保留指数定性，结合气味特征以及查阅相关文献，,2种方法共鉴定出44种香气活性化合物，其中SDE/GC-O共鉴定出43种香气活性化合物，SAFE/GC-O共鉴定出33种香气活性化合物。SDE法鉴定出的香气化合物要多于SAFE法，但不完全包含，2种方法互相补充。2种方法共鉴定出的香气活性化合物包括烃类9种、醇类17种、醛类6种、酯类7种、酮类1种、酚类1种、杂环及其他化合物3种。由于仪器灵敏度要低于人类嗅觉的灵敏度，所以表2中，别罗勒烯、1-辛炔-3-醇、γ-萜品醇、异胡椒烯醇、毕橙茄醇、甲基庚烯酮、2,6-二叔丁基对甲苯酚等21种香气活性化合物在GC-MS中未检出。

由表2可知，检测到的烃类香气活性化合物中稀释因子较高的(FD≥34)有月桂烯(清凉中药味)、柠檬烯(清甜、花香)、大根香叶烯D(花香)，三者在植物和水果中常见，主要提供青香、花香、木香以及果香，使香气闻起来透发性较好。醇类香气活性化合物中稀释因子较高(FD≥34)的有芳樟醇(青香、辛香)、反式-薄荷基-2,8-二烯-1-醇(树叶味)，YANG[18]分析了红花椒和青花椒的主要成分中芳樟醇的含量，差异性较大，说明芳樟醇是影响花椒椒麻气味的主要因素，反式-薄荷基-2,8-二烯-1-醇是薄荷精油的主要成分之一。醛类中稀释因子较高(FD≥34)的反式-2,4-庚二烯醛(烤香)天然存在于欧洲越橘、酸果蔓的果实以及花生中，有脂肪、油腻以及烤香的香气特征。SAFE法鉴定出的甲基庚烯酮具有柠檬草和乙酸异丁酯的香气，是医药、香精和香料合成的重要中间体[19]。甲基庚烯酮不仅在许多植物原料中有检出，陈怡颖等[20]用固相微萃取鸡肉酶解液中也检出了少量的甲基庚烯酮。

表2中有14种未定性的香气活性化合物，香气类型有奶香、烤焦味、霉味、糊味以及清凉味等，其中稀释因子较高(FD≥34)的有3种化合物，主要提供奶香、甜味以及清凉味，FD≥37的2种化合物对炸花椒油风味贡献度很大，虽然其本身的香气并不是炸花椒油的主体风味，但是与其他香气化合物混合调配之后，有可能对炸花椒油的咸香风味有着突出的贡献。

3 结论

本文采用SDE法和SAFE法提取炸花椒油中的挥发性风味成分，结合GC-MS共鉴定出75种挥发性风味成分，应用AEDA结合GC-O分析炸花椒油中的香气活性化合物，2种方法共分析出58个气味活性区域，鉴定出44种香气活性化合物，其中稀释因子FD≥34的芳樟醇、大根香叶烯D、柠檬烯、乙酸芳樟酯、乙酸-4-松油烯醇酯等是炸花椒油中的关键性香气活性化合物。相比之前关于生花椒的分析，本文对炸花椒油中的香气活性化合物以及贡献度有了初步的探索，有利于新产品的开发以及相关香精产品的研制。

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Identification of key aroma-active compounds of fried zanthoxylum essential oil by aroma extract dilution analysis and gas chromatography-olfactometry-mass spectrometry

CHEN Hai-tao1,2,3*,SUN Feng-yi1,WANG Dan1,SUN Bao-guo1,2,3,ZHANG Yu-yu1,2,3

1(Beijing Advanced Innovation Center for Food Nutrition and Human Health， Beijing Technology and Business University (BTBU), Beijing 100048,China) 2(Beijing Key Laboratory of Flavor Chemistry，Beijing Technology and Business University (BTBU), Beijing 100048,China) 3(Beijing Laboratory for Food Quality and Safety, Beijing Technology and Business University (BTBU), Beijing 100048,China)

Volatile flavor constituents of fried zanthoxylum essential oil were extracted by simultaneous distillation and solvent-assisted flavor evaporation. The extracts were analyzed qualitatively and quantitatively by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) .The key aroma compounds of the extract was identified by aroma extract dilution analysis coupled with gas chromatography and olfactometry (GC-O) . A total of 75 volatiles were identified in fried zanthoxylum essential oil, including 19 hydrocarbons, 13 aldehydes, 22 alcohols, 5 ketones, 8 ethers and 8 heterocyclic compounds; a total of 58 olfactory active regions were found and 44 of them were identified. Those of higher flavor dilution factors (FD≥34) were linalool, germacrene D, limonene, linalyl acetate, 4-terpinenyl acetate, etc, which were the key aroma-active compounds of fried zanthoxylum essential oil.

fried zanthoxylum essential oil; simultaneous distillation and extraction; solvent-assisted flavor evaporation; aroma extract dilution analysis

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201703034

硕士,副教授(本文通讯作者，E-mail：chenht@th.btbu.edu.cn)。

“十二五”国家科技支撑计划项目(2014BAD04B06)；2016年研究生科研能力提升计划项目资助

2016-06-14，改回日期：2016-08-12