片仔癀对肝癌干细胞增殖及凋亡的影响

魏丽慧，齐飞，彭军，严茂林，邱福南，白燕南，王耀东

（1.福建中医药大学中西医结合研究院，福建福州350122；2.福建省中西医结合老年性疾病重点实验室，福建福州350122；3.福建省立医院，福建福州350001；4.福建医科大学省立临床医学院，福建福州350001）

·实验研究·

片仔癀对肝癌干细胞增殖及凋亡的影响

魏丽慧1，2，齐飞1，2，彭军1，2，严茂林3，4，邱福南3，4，白燕南3，4，王耀东3，4

（1.福建中医药大学中西医结合研究院，福建福州350122；2.福建省中西医结合老年性疾病重点实验室，福建福州350122；3.福建省立医院，福建福州350001；4.福建医科大学省立临床医学院，福建福州350001）

目的利用克隆球培养法富集肝癌干细胞，研究片仔癀对肝癌干细胞增殖及凋亡的影响。方法采用克隆球培养法对肝癌干细胞进行富集，采用RT-PCR检测肝癌细胞及肝癌干细胞中自我更新基因Oct-4 mRNA的表达；利用流式细胞仪检测肝癌细胞及肝癌干细胞表面标记蛋白CD133、CD90表达；采用台盼蓝计数方法检测片仔癀对肝癌干细胞增殖的影响；利用Hoechst33342染色法检测片仔癀对肝癌干细胞凋亡的影响。结果采用克隆球培养法可富集成球生长的肝癌干细胞；与肝癌细胞比较，肝癌干细胞Oct-4、CD133、CD90高表达（P＜0.05）；片仔癀给药后可显著抑制肝癌干细胞的增殖（P＜0.05），并增加肝癌干细胞中凋亡的细胞。结论片仔癀具有抑制肝癌干细胞增殖及诱导其凋亡的作用。

片仔癀；肝癌；肝癌干细胞；增殖；凋亡

肝癌是常见的恶性肿瘤之一，其死亡率位于恶性肿瘤第二位［1］。随着对肿瘤发病机制的逐步阐明，近年来在肝癌的诊疗方面有了较大的进展，但由于肿瘤转移、复发、化放疗的耐受性和毒副作用等问题仍然存在，总的预后改善并不明显［2］。肿瘤干细胞（cancen stem cells，CSCs）被认为是肿瘤发生发展、转移、复发的根源［3］。因此，针对肿瘤干细胞的治疗是目前根除肝癌的最有效治疗方法之一。

（五）职能拓展，能力素质要求高。调整改革后的省军区系统，在保留国防动员、兵员征集、国防教育、国防设施保护、双拥工作主要职能的基础上，又拓展了军民融合协调和老干部服务管理保障两项职能，职能任务更加宽泛，特别是省军区融入战区作战指挥链后，统筹协调军地力量参与信息化条件下联合作战，面向三军搞好动员保障，组织指挥后备力量遂行应急应战等任务更加繁重。这就要求省军区系统广大官兵，既要懂平时动员建设、又要懂战时联合指挥，既要会抓部队管理、又要善于沟通协调，既要熟悉陆军部队、又要了解其他军种，既要精通军事业务、又要知晓地方经济。

对包括肝癌在内多种恶性肿瘤有明确治疗作用的片仔癀基础研究［4－5］发现：其具有诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞增殖、抗肿瘤血管新生的作用［6-8］，但对于肝癌干细胞的研究尚未见报道。因此，为了进一步揭示片仔癀治疗肝癌的作用机制，本文以肿瘤干细胞为切入点，研究片仔癀对肝癌干细胞增殖及凋亡的影响。

1材料

1.1药物和细胞株片仔癀粉末由漳州片仔癀药业股份有限公司提供；人肝癌细胞株HepG2购自美国ATCC细胞库。

1.2主要试剂及耗材MEM培养基、DMEM／F12培养基、0.25%胰蛋白酶、胎牛血清（FBS）、B-27 Supplement、Antibiotic-Antimycotic、干细胞消化酶、PCR master mix（美国Thermo Fisher Scientific公司）；human EGF、human FGF-basic（美国Peprotech

公司）；磷酸盐缓冲液（PBS）、青霉素-链霉素（美国Gibco公司）；CD133抗体（德国Miltenyi Biotec公司）；CD90抗体（美国BD公司）；Oct-4引物（上海捷瑞生物工程有限公司）；Hoechst33342（美国Sigma公司）；4%台盼蓝（美国Amresco公司）；逆转录试剂盒（中国宝生物工程大连有限公司）；低黏附6孔板（美国Corning公司）。

2.6台盼蓝计数法检测片仔癀对肝癌干细胞增殖的影响利用干细胞消化酶消化肝癌干细胞，计数并调整细胞密度，以1.0×105个／mL接种于6孔板中；分成对照组、片仔癀低、中、高剂量组，每个浓度重复3孔，干预24 h后，消化收集细胞；用培养液重悬细胞后，进行计数，得到活细胞数值，并按下列公式计算：

2方法

3.2功能学验证采用RT-PCR检测肝癌细胞及肝癌干细胞中Oct-4 mRNA的表达，见图2。与肝癌细胞比较，肝癌干细胞Oct-4 mRNA明显高表达（P＜0.05）。采用流式细胞仪检测CD133、CD90的表达，见图3。与肝癌细胞比较，肝癌干细胞中CD133＋CD90＋细胞所占比例明显增高，证实了克隆球可以作为富集肝癌干细胞的方式。

2.2肝癌细胞的培养及分组肝癌细胞（HepG2）用含10%FBS的MEM培养液（含100 U／mL青霉素、100 μg／mL链霉素），置于37℃含5%CO2饱和湿度的培养箱中培养；细胞生长至汇合度达80%左右时，加入0.25%胰蛋白酶进行消化，3 min后，观察细胞变圆且部分漂浮时加入2倍体积含10% FBS的新鲜培养基终止消化，1 000转／min离心5 min，弃上清收集沉淀细胞。用含10%FBS的MEM完全培养液重悬制成单细胞悬液后传代或接板。

细胞存活率／%＝（片仔癀药物组活细胞数值／对照组活细胞数值）×100%。

3.1克隆球富集肝癌干细胞肝癌细胞接种于低粘附6孔板中，用干细胞培养液进行培养，10 d后，发现肝癌干细胞呈克隆球状生长；肝癌细胞在含10%FBS的MEM培养液中则呈贴壁生长，结果见图1。

2.4RT-PCR检测Oct-4 mRNA的表达收集肝癌细胞、肝癌干细胞，分别加入Trizol，参照Trizol试剂（美国Invitrigen公司）说明书提取总RNA。取总RNA 1 μg，应用逆转录（RT）试剂盒进行逆转录反应为cDNA。进行PCR反应，PCR反应体系（20 μL体系）：cDNA 1 μL，PCR master mix 10 μL，上下游引物各1 μL，加DEPC水至20 μL，震荡混匀，高速离心10 s后，置PCR热循环仪扩增；扩增条件为：95℃预变性4 min，94℃变性30 s，58℃退火35 s，72℃延伸40 s，持续35个循环，最后72℃延伸10 min。Oct-4引物序列：上游5′-GGTATTCAGCCAA ACGACCATCT-3′，下游5′-TCTCACTCGGTTCTCG ATACTGG-3′。PCR产物经在1.5%琼脂糖凝胶上电泳后进行光密度扫描，以GAPDH基因为内参，各基因的扩增条带的光密度值与各自内参的光密度值之比作为衡量参数，采用Quantity one软件分析。

2.7Hoechst33342检测片仔癀对肝癌干细胞凋亡的影响利用干细胞消化酶消化肝癌干细胞，计数并调整细胞密度，以1.0×105个／mL接种于6孔板中；分成对照组、片仔癀低、中、高剂量组，每个浓度重复3孔；干预24 h后，去除上清，用PBS清洗1次，用4%多聚甲醛37℃固定10 min，用PBS清洗3次，每次5 min；加入Hoechst33342，避光，在室温孵育10 min；再用PBS清洗3次后，加入适量的PBS，在荧光显微镜下进行观察并拍照。

培训业务单位的功能设计主要体现在逻辑方面，比如，培训业务单位的管理逻辑、控制逻辑及培训示范村逻辑等。其中，管理工作者在创建新的工程县信息的过程中，首要工作是收到新的请求，并通过培训业务管理控制体系，传达到控制调用位置，从而完成新项目的增添。

1.3主要仪器超净工作台（苏州净化设备有限公司）；二氧化碳培养箱、低速普通离心机（美国Thermo Fisher Scientific公司）；5417R高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司）；荧光倒置显微镜系统（日本Olympus公司）；倒置显微镜系统（德国Leica公司）；MOFLO XDP高速分选型流式细胞仪（美国Beckman coulter公司）；细胞计数系统（美国Countstar公司）；PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司）。

建功新时代，扬帆新征程。当前，苏州正在以习近平新时代中国特色社会主义思想为指导，自觉用新思想定向领航，以新思想对标找差，从新思想寻策问道，按照省委决策部署和对苏州工作提出的新要求，围绕推动高质量发展，深化实施十二项“三年行动计划”，为再创新辉煌夯实坚固基础、注入强劲活力、再添秀美气质、绘就艳丽华章。

2.5流式细胞仪检测CD133、CD90的表达分别用胰酶、干细胞消化酶将肝癌细胞、肝癌干细胞消化成单细胞，用PBS清洗1次，重悬细胞，调整细胞数为1.0×106个／100 μL，加入CD133抗体（FITC荧光标记）10 μL、CD90抗体（PE荧光标记）5 μL，避光，室温孵育15 min；再用PBS清洗1次，用500 μL PBS重悬上机进行检测。

其中一类调控机制是小RNA介导的转录调控，小RNA是一种非编码单链RNA分子，会识别与之序列相匹配的转录本，并和其他蛋白一起将其降解。“但如果因为可变剪接表达出不含相应识别位点的转录本，则不会受此影响。”刘海军说。

2.8统计学方法实验数据采用SPSS17.0版统计软件进行分析。计量资料采用t检验，多个样本均数比较采用方差分析。

3结果

2.3肝癌干细胞的培养和分组2.2中所获得的肝癌单细胞悬液接种于低粘附6孔板中，每孔接种1 000个细胞，在干细胞培养液中富集克隆球，10 d后，将形成的克隆球细胞作为肝癌干细胞用于后续实验。分成对照组（0 mg／mL）、片仔癀低剂量组（0.25 mg／mL）、片仔癀中剂量组（0.5 mg／mL）、片仔癀高剂量组（0.75 mg／mL）。

防水涂料是一种液态或半液态的物质，在建筑表面采用刷子或喷涂等施工技术，通过化学反应形成一个连续的、具有一定的弹性和厚度的薄膜，这样可以抵抗一定的水压力，从而达到防水和防潮的目的。防水涂料是一种特殊的涂料，其特殊性在于涂层表面可以形成一个柔软、防水、抗裂的防水结构层，阻挡水分子从外部向基层渗透。因此，与普通建筑涂料的原材料有所不同，这种防水涂料主要采用憎水性强、耐水性好的有机高分子涂层如聚氨酯、氯丁橡胶、再生橡胶、SBS橡胶沥青及其混合料，辅助材料主要采用固化剂、增韧剂、增粘剂、防腐剂、染色剂和乳化剂等，其生产工艺和膜的形成与普通建筑涂料的原理基本上是相同的。

图1肝癌细胞及肝癌干细胞生长形态图（×100）

2.1片仔癀溶液的配制将片仔癀粉末用PBS配制成20 mg／mL的溶液，放于超声机中进行超声溶解，经灭菌处理后放于-20℃冰箱贮存备用。

3.3片仔癀对肝癌干细胞增殖的影响采用台盼蓝计数法检测片仔癀干预后，肝癌干细胞的存活情况，见图4。与对照组比较，片仔癀中、高剂量组肝癌干细胞的存活率明显降低（P＜0.05），提示片仔癀具有抑制肝癌干细胞增殖的作用。

综上所述，国内外学者对水牛乳的理化特性都进行了大量研究，但要充分了解我国水牛乳理化和生物学特性还需要大量研究。此外，在研究时，还需要特别注意乳水牛品种、生活地域环境、产乳胎次等因素，才能得出较为客观的结论。

3.4片仔癀对肝癌干细胞凋亡的影响采用Hoechst33342检测片仔癀对肝癌干细胞凋亡的影响，见图5。凋亡的细胞呈高亮状态，片仔癀干预24 h后，与对照组比较，片仔癀组肝癌干细胞凋亡的细胞数量明显增多，提示片仔癀具有诱导肝癌干细胞凋亡的作用。

4讨论

图2RT-PCR检测Oct-4 mRNA的表达情况

图3流式细胞仪检测CD133+CD90+的表达情况

图4片仔癀对肝癌干细胞增殖的影响

图5片仔癀诱导肝癌干细胞凋亡图（×100）

肿瘤干细胞理论的提出，更新了人们对肿瘤发生、发展、转移、复发的理解。认为肿瘤干细胞是肿瘤形成的起始细胞并维持肿瘤的生长，而肿瘤中绝大多数细胞不能自我更新，而是经过有限的增殖之后最终走向凋亡。因此，普通肿瘤细胞播散可能不会导致肿瘤的转移、复发，而肿瘤干细胞才是导致肿瘤转移、复发的根源。近年来，在多种实体瘤中证实肿瘤干细胞的存在，如乳腺癌、肝癌、大肠癌［9-11］。以手术切除为主的综合治疗是目前肝癌治疗最有效的方法，但是，根治性切除后病人5 a生存率仍然低，且存在复发及转移的问题［2］。因此，针对肿瘤干细胞的治疗是目前肝癌研究的热点之一［12］。

肿瘤干细胞有多种分选富集方法，在无血清的干细胞培养基中培养悬浮克隆球是常用的方法之一。Oct-4是目前公认最早的干细胞调控因子，在维持干细胞自我更新及多潜能性发挥着重要的作用［13］，可用于干细胞的干性验证。且研究发现：包括肝癌在内的多种恶性肿瘤中均有Oct-4的异常表达，并与肿瘤的发生、发展密切相关［14］。CD133、CD90是目前用于分选肝癌干细胞的重要表面标记物［15-16］，但目前，肝癌干细胞的标志物研究还只局限于从正常肝干／祖细胞的表面标志物去推定，尚缺乏特异性标志物来鉴定和分离肝癌干细胞。因此，本实验用克隆球富集的方式，并利用Oct-4及CD133、CD90进行验证。实验结果证实：克隆球细胞中Oct-4基因及CD133+CD90+细胞显著增高。

具有清热解毒、消肿散结、活血化瘀功效的片仔癀，一直以来，在民间以及东南亚地区被广泛用于包括肝癌在内的消化道恶性肿瘤的治疗，但对于肝癌干细胞的作用尚未见报道。因此，本研究通过克隆球富集肝癌干细胞，并观察片仔癀对肝癌干细胞增殖及凋亡的影响。实验结果显示：片仔癀干预后，可显著抑制肝癌干细胞的生存率，并显著增加肝癌干细胞中凋亡细胞的数量，揭示了片仔癀具有抑制肝癌干细胞增殖及诱导其凋亡的作用。

［1］JEMAL A，BRAY F，CENTER M M，et al.Global cancer statistics，2011［J］.CA Cancer J Clin，2011，61（2）：69-90.

［2］FAN S T，MAU LO C，POON R T，et al.Continuous improvement of survival outcomes of resection of hepatocellular carcinoma：a 20-year experience［J］.Ann Surg，2011，253（4）：745-758.

［3］REYA T，MORRISON S J，CLARKE M F，et al.Stem cells，cancer，and cancer stem cells［J］.Nature，2001，414（6859）：105-111.

［4］徐益语，于尔辛．以片仔癀为主治疗中晚期肝癌42例临床分析［J］．上海中医药杂志，1994，39（12）：4-5．

［5］刘丛盛．片仔癀药理及临床应用综述［J］．医药世界，2006，7（7）：54.

［6］LIN J M，WEI L H，CHEN Y Q，et al.Pien Tze Huang-induced apoptosis in human colon cancer HT-29 cells is associated with regulation of the Bcl-2 family and activation of caspase 3［J］. Chin J Integr Med，2011，17（9）：685-690.

［7］ZHUANG Q C，HONG F，SHEN A L，et al.Pien Tze Huang inhibits tumor cell proliferation and promotes apoptosis via suppressing the STAT3 pathway in colorectal cancer mouse［J］.Int J Oncol，2012，40（5）：1569-1574.

［8］SHEN A L，HONG F，LIU L Y，et al.Effects of Pien Tze Huang on angiogenesis in vivo and in vitro［J］.Chin J Integr Med，2012，18（6）：431-436.

［9］AL-HAJJ M，WICHA M S，BENITO-HERNANDEZ A，et al. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells［J］. Proc Natl Acad Sci USA，2003，100（7）：3983-3988.

［10］O'BRIEN C A，POLLETT A，GALLINGER S，et al.A human colon cancer cell capable of initiating tumour growth in immunodeficient mice［J］.Nature，2007，445（7123）：106-110.

［11］MA S，CHAN K W，GUAN X Y.In search of liver cancer stem cell［J］.Stem Cell Rev，2008，4（3）：179-192.

［12］KORKAYA H，WICHA M S.Selective targeting of cancer stem cells：a new concept in cancer therapeutics［J］.Bio Drugs，2007，21（5）：299-310.

［13］NIWA H，MIYAZAKI J，SMITH A G.Quantitative expression of Oct-3／4 defines differentiation，dedifferentiation or self-renewal of ES cells［J］.Nat Genet，2000，24（4）：372-376.

［14］张明．肝癌细胞中OCT-4、SOX2和NANOG的表达及其临床意义［D］．石家庄：河北医科大学，2012．

［15］MA S，CHAN K W，HU L，et al.Identification and characterization of tumorigenic liver cancer stem／progenitor cells［J］.Gastroenterology，2007，132（7）：2542-2556.

［16］YANG Z F，HO D W，NG M N，et al.Significance of CD90+ cancer stem cells in human liver cancer［J］.Cancer Cell，2008，13（2）：153-166.

R285.5

A

1000-338X（2017）02-0027-04

2016-12-22

福建省卫生教育联合攻关计划项目（WKJ-FJ-21）；福建省教育厅科技项目A类（JA14162）；福建省自然科学基金项目（2014J01404）

魏丽慧（1985—），女，实验师，主要从事中西医抗肿瘤机制研究。

王耀东（1956—），男，主任医师，硕士生导师。

E-mail：wangyaodongch@163.com