LC-MS/MS定性分析大鼠尿液中益智提取物的成分及其代谢产物

李佩佩，刘韶，文琪，麦世瑛，张俊清

（1.中南大学湘雅医院，湖南 长沙 410008；2.海南医学院，海南 海口 571199）

LC-MS/MS定性分析大鼠尿液中益智提取物的成分及其代谢产物

李佩佩1，刘韶1，文琪2，麦世瑛2，张俊清2

（1.中南大学湘雅医院，湖南 长沙 410008；2.海南医学院，海南 海口 571199）

目的 通过LC-MS/MS法检测大鼠尿液中益智提取物中10种活性成分的存在形式。方法采用LC-MS/MS法检测灌胃给药后0～4 h、4～8 h、8～24 h大鼠尿液中的益智代谢产物，与给药前大鼠空白尿液MRM图进行比对。结果实验组大鼠尿液中9种主要活性成分均以原形化合物的形式存在，而未发现山柰酚及其葡萄糖酸代谢产物。结论大鼠灌胃益智提取物后，益智活性成分在大鼠尿液中的物质形式以原形为主，为理解这些物质在大鼠体内的消除途径提供部分参考依据。

益智提取物；尿排泄；定性分析；LC-MS/MS

现代药理学研究表明益智(Alpinia oxyphylla Miq.)有镇痛、镇静、催眠、神经保护、改善记忆、抗肿瘤等显著生物学活性，但目前对益智的研究主要集中在化学成分、毒理、药理药效研究等方面，对于益智在体内的研究则相对较少[1-5]。中药成分的复杂性及其质量的难控性，使得中药分析方法必须具有高的灵敏度、强的抗干扰能力等特点。LC-MS/MS技术具有抗干扰能力强、分析速度快、定性能力强、检测灵敏度高等优点，不仅可以快速鉴定中药中的己知化学成分，还能检测出未知化学成分[6-7]。因此，通过LC-MS/MS技术研究益智提取物在大鼠尿液中代谢物的种类，为益智提取物在体内的代谢途径研究及其后续的定量分析提供了参考依据。

1 材料与方法

1.1 仪器 AB-SCIEX API 4000+串联四级杆质谱仪，美国AB公司；Prominence UFLC液相色谱仪，LC-20AD双泵系统，DGU-20A3R在线脱气机，SIL-20AHT自动进样器，CTO-20A柱温箱，均岛津公司；Phenomenex Kinetex 2.6µm XB-C18色谱柱，广州FLM科学仪器有限公司；Lab Tower EDI15系统，Thermo Scientific公司。

1.2 试药与试剂

1.2.1 试剂及标准品 诺卡酮(Nootkatone)，Sigma chemical公司；益智酮甲(Yakuchinone A)、益智酮乙(Yakuchinone B)、益智醇(Oxyphyllacinol)，上海凯方医药科技公司；山柰素(Kaempferide)、山柰酚(Kaempfer-ol)，曼斯特生物科技有限公司。标准品杨芽黄素(Tectochrysin)，白杨素(Chrysin)，伊砂黄素(Izalpinin)，芹菜素-4'，7-二甲氧醚(5-Hydroxy-4'，7-dimethoxy-flavone)由本课题组从益智中分离制备，通过UV、NMR和MS进行结构鉴定，用HPLC-DAD-MS进行纯度测定，其纯度均在98%以上。每个标准品分别用甲醇配制为1 mg/mL的溶液，-40℃避光贮存。色谱纯级甲醇和乙腈，美国天地公司；色谱级甲酸，上海阿拉丁公司；其他化学试剂(分析级或以上级别)，海南诣高仪器有限公司。

1.2.2 益智提取物 获得益智提取物，通过LC-MS/MS法测得每毫克的益智提取物中含有82.8µg诺卡酮、28.3µg益智酮甲、0.12µg益智酮乙、21.1µg益智醇、1.499µg杨芽黄素、0.14µg白杨素、0.07µg伊砂黄素、1.46µg芹菜素-4',7-二甲氧醚、0.12µg山柰素。

1.3 实验动物 15只健康成年雄性SD大鼠，等级为优，体质量约为350 g，由长沙东创实验动物服务部提供。于温度为22℃～26℃，湿度50%～70%条件下饲养，试验前禁食12 h自由饮水。常规适应性饲养1周，无不良反应者进入实验。

1.4 方法

1.4.1 色谱条件 使用phenomenex Kinetex 2.6 µXB-C18色谱柱(2.10 mmi.d.×50 mm)进行样品的分离分析，柱温40℃；流动相为含0.1‰甲酸的水(A相)-含0.1‰甲酸的乙腈(B相)；洗脱梯度：0～1 min为0% B，1～1.01 min B相从0迅速增加到30%，1.01～10 min B相从30%缓缓增加到100%，10～10.01 min从100%回到0，10.01～15 min维持在0%B进行平衡；流速为0.35 mL/min。

1.4.2 质谱条件 ESI(+)模式，喷雾电压5 500伏，GS1为55 psi，GS2为55 psi，帘气为25 psi，喷雾温度为550ºC。采用RMR模式进行扫描，每个离子对的扫描时间为20 ms，见表1、表2。

表1 10种化合物的检测离子对

表2 上述9种化合物二相代谢产物（葡萄醛酸化代谢物）的检测离子对

1.4.3 动物试验方案 取益智提取物流浸膏，加入少量吐温80助溶，用纯水分别配置成0.09 g/mL、0.27 g/mL、0.81 g/mL的混悬液。动物实验前1 d进行抓拿适应性实验，置于代谢鼠笼中适应1 d，收集空白尿样品。15只大鼠灌胃给予益智提取物混悬液，给药体积为1.00 mL/100 g，给药剂量为8.1 g/kg。放入代谢笼内，收集给药后0～4 h、4～8h、8～24 h尿液，置于-80℃冰箱存至分析。

1.4.4 尿液样品处理 分别取200μL尿液样品，加入600μL甲醇，振摇后放在漩涡振荡器上震荡(1 500 r/min)提取10 min，13 000 r/min下离心10 min，吸取上清液，在37℃条件下N2吹干。用50µL甲醇复溶上述N2吹干的含有待分析成分的样品，再在振荡器上震荡(1 500 r/min)提取5 min，13 000 r/min离心5 min，吸取45µL，供LC-MS-MS分析用。

2 结果

收集3个时间段的大鼠尿液样品经处理后，分别通过LC-MS/MS法检测，再将3个时间段大鼠尿液中的益智提取物及其代谢产物保留时间的MRM图合并，并依次和图1中标准物质的保留时间进行对比。发现实验大鼠尿液中益智提取物中除山奈酚外，其他9种活性成分均以物质原形存在，并未检测到相关的二相代谢产物。

2.1 诺卡酮 大鼠尿液中可检测到诺卡酮原形物质，见图2(tR为6.06，图1)。

2.2 益智酮甲及其葡萄糖醛酸化代谢产物 在大鼠尿液中发现益智酮甲原形化合物，见图3A(tR为5.95 min，图1)，未发现益智酮甲-葡萄糖醛酸化代谢物，见图3B。

2.3 益智酮乙及其葡萄糖醛酸化代谢产物 在大鼠尿液中存在益智酮乙原形化合物，见图4A(tR为5.90 min，图1)，未发现益智酮乙-葡萄糖醛酸化代谢物，见图4B。

2.4 益智醇及其葡萄糖醛酸化代谢产物 在大鼠尿液中发现益智醇原形物质，见图5A，未发现益智醇-葡萄糖醛酸化代谢物，见图5B。

2.5 杨芽黄素及其葡萄糖醛酸化代谢产物 在大鼠尿液中发现杨芽黄素原形物质，见图6A(tR为5.86 min，图1)，未发现杨芽黄素-葡萄糖醛酸化代谢物，见图6B。

2.6 白杨素及其葡萄糖醛酸化代谢产物 在大鼠尿液中发现白杨素原形物质，见图7A(tR为4.52 min，图1)，未发现白杨素-葡萄糖醛酸化代谢物，见图7B。

2.7 伊砂黄素及其葡萄糖醛酸化代谢产物 在大鼠尿液中发现伊砂黄素原形化合物，见图8A(tR为5.98 min，图1)，未发现伊砂黄素-葡萄糖醛酸化代谢物，见图8B。

2.8 芹菜素-4',7-二甲氧醚及其葡萄糖醛酸化代谢产物 在大鼠尿液中发现芹菜素-4'，7-二甲氧醚原形化合物，见图9A(tR为5.91 min，图1)，未发现芹菜素-4'，7-二甲氧醚-葡萄糖醛酸化代谢物，见图9B。

2.9 山柰素及其葡萄糖醛酸化代谢产物 在大鼠尿液中发现山柰素原形物质图，见10A(tR为4.69 min，图1)，未发现山柰素-葡萄糖醛酸化代谢物，见图10B。

2.10 山奈酚及其葡萄糖醛酸化代谢产物 在大鼠尿液中未发现山奈酚原形化合物，见图11A(tR为3.69 min，见图1)及其葡萄糖醛酸化代谢产物，见图11B。

图1 益智10种活性成分标准品保留时间（tR）

图2 大鼠尿液中诺卡酮(Nootkatone)的MRM图

图3 大鼠尿液中益智酮甲和其葡萄糖醛酸化代谢物的MRM图

图4 大鼠尿液中益智酮乙和其葡萄糖代谢物的MRM图

图5 大鼠尿液中益智醇和其葡萄糖醛酸化代谢物的MRM图

图6 大鼠尿液中杨芽黄素和其葡萄糖醛酸化代谢物的MRM图

图7 大鼠尿液中白杨素和其葡萄糖醛酸化代谢物的MRM图

图8 大鼠尿液中伊砂黄素和其葡萄糖醛酸化代谢物的MRM图

图9 大鼠尿液中芹菜素-4'，7-二甲氧醚和其葡萄糖醛酸化代谢物的MRM图

图10 大鼠尿液中山柰素和其葡萄糖醛酸化代谢物的MRM图

图11 大鼠尿液中山奈酚和其葡萄糖醛酸化代谢物的MRM图

3 讨论

本文旨在研究大鼠灌胃给药益智提取物后目标成分在大鼠尿液中的存在形式。此前的研究表明，益智中的包括二芳基庚烷类、黄酮类等9种代表性成分在大鼠血浆中主要以葡萄糖醛酸结合物的形式存在[8]。借助LC-MS/MS技术，通过标准品色谱图谱的比对，证实大鼠尿液中存在浓度较低的原形物质，并未检测到二相结合代谢产物。由于二芳基庚烷类成分、黄酮类成分等生物利用度普遍偏低，再加上部分通过胆汁排泄的形式进入肠道，除去重吸收的部分，大部分从粪便中消除[5]。因此推测这些成分在尿中的浓度处于较低水平。为实现有效检测的目的，样品处理时采用了高剂量给药下收集的不同时段的尿液，经甲醇沉淀经离心后得到上清液再吹干复溶。试验中发现复溶溶剂对目标成分的分析产生了不同的影响，这对同类物质的分析具有一定的借鉴作用。

本文仅对大鼠灌胃给药后益智中的代表性成分在尿液中的物质形式进行了定性分析，这些物质的经肾的排泄比例尚待进一步研究。

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LC-MS/MS-based qualitative analysis of the main substances and metabolites of Alpinia oxyphylla extract in rat urine after intragastric administration.

LI Pei-pei1,LIU Shao1,WEN Qi2,MAI Shi-ying2,ZHANG Jun-qing2. 1.Xiangya Hospital School of Medicine,Central South University,Changsha 410008,Hu'nan,CHINA;2.Hainan Medical University,Haikou 571199,Hainan,CHINA

ObjectiveTo study the existing form of the 10 main active compounds of Alpinia oxyphylla extract in rat urine by liquid chromatography/tandem mass spectrometry(LC-MS/MS)after oral administration.MethodsThe metabolites of of Alpinia oxyphylla extract in urine of rats 0-4 h,4-8 h and 8-24 h after dosing were detected by LC-MS/MS method,which was used to compare with the multiple reaction monitoring(MRM)mode of rat urine samples before dosing.ResultsThe nine active compounds detected in real rat urine samples were parent forms in rats after oral administration of Alpinia oxyphylla extract,and no kaempferoland its metabolites of gluconic acid were found.ConclusionThe main substances detected in urine were parent forms of Alpinia oxyphylla extract in rats after administration,which can provide the references to understand the elimination of these substances in rats.

Alpinia oxyphylla extract;Urinary excretion;Qualitative analysis;LC-MS/MS

R-332

A

1003—6350（2017）09—1450—05

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.09.027

2016-12-20)

刘韶。E-mail：545272666@qq.com