银杏花粉及其发酵饮料对小鼠的急性毒性评价

王未名 裘纪莹 刘孝永 辛雪 孙华 陈蕾蕾 张翔 王易芬 陈相艳

摘要[目的]评价银杏花粉及其发酵饮料的食用安全性。[方法]选择健康小鼠进行急性毒性试验，开展了大剂量预试验及小鼠最大给药量试验，并测定了该剂量下的小鼠胸腺系数和脾脏系数。[结果]大剂量预试验小鼠均未死亡，未有异常反应，不能测出LD50。最大给药量试验显示，小鼠灌胃给药后除银杏花粉组1只小鼠意外死亡外，其他小鼠均未发生死亡或中毒症状，活动、脏器等均未见异常。银杏花粉和银杏花粉发酵饮料的最大给药量分别为21.1 g/kg体重和80.0 mL/kg体重，此最大给药量远高于可能摄入的最高剂量；同时在此剂量下银杏花粉及其发酵饮料能够增加雄性小鼠的胸腺系数和脾脏系数。[结论]银杏花粉及其发酵饮料对小鼠没有急性毒性作用，并且提示对雄性小鼠可能具有一定的免疫增强作用。

关键词银杏花粉；小鼠；急性毒性；最大给药量

中图分类号TS201.6文献标识码A文章编号0517-6611（2017）05-0077-02

Abstract[Objective] To evaluate the edible safety of ginkgo pollen and its fermentation beverage. [Method] Healthy mice were chosen for acute toxicity test. Highdose pilot study and maximum dose experiment were carried out， as well as determination of the thymus and spleen coefficients of the mice in this dose. [Result] The mice in the highdose pilot study were all alive， no abnormal reaction， and the LD50 could not be measured. The maximum dose experiment showed that except the accidental death of one mouse， no other death or poisoning symptoms occur， and the activities and organs were all normal. The maximum dose of ginkgo pollen and its fermentation beverage were 21.1 g/kg and 80.0 mL/kg， respectively. These dose were much higher than those could be ingested， and the thymus and spleen coefficients of the mice in this dose were increased. [Conclusion] There are no acute toxic effects of ginkgo pollen and its fermentation beverage on mice， and prompting that they might have some immune enhancement effects on male mice.

Key wordsGinkgo pollen；Mice；Acute toxicity；Maximum administration dosage

基金項目山东省自然科学基金三院联合基金项目（ZR2014YL020，ZR2016YL022）；国家科技支撑计划（2015BAD16B02）；山东省农业科学院青年科研基金项目（2014QNM47）；泰山学者专项工程项目；山东省农业科学院青年英才培养计划。

作者简介王未名（1957—），男，山东济南人，研究员，从事植物保护与农产品加工研究。*通讯作者，研究员，硕士，从事农产品加工研究。

收稿日期2016-12-09

银杏花粉是银杏雄株的花粉，营养丰富并且富含黄酮、萜内酯等活性组分。研究显示，银杏花粉24种游离氨基酸总量达62.316 mg/g，钾离子含量达26.301 mg/g[1]，黄酮类化合物总量约为20.44 mg/g[2]，其中芦丁、槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖-（4→1）-β-L-吡喃鼠李糖苷和山柰酚含量分别为120.90、114.00和222.10 μg/g[3]，具有广阔的开发利用价值。目前在银杏花粉的开发利用方面有部分报道，如孙谨先[4]报道了一种银杏花粉胶囊及其制备方法，曹福亮等[5]开展了银杏花粉食品的加工工艺研究，裘纪莹等[6]以银杏花粉为原料研究开发了银杏花粉发酵饮料，但银杏花粉原料以及报道产品的安全性研究尚少见报道，这大大限制了银杏花粉在普通食品及功能性食品领域的应用。因此，笔者开展了银杏花粉及其发酵饮料对小鼠的急性毒性研究，旨在为银杏花粉的食用安全性提供参考。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1

银杏花粉供试品。银杏花粉采自山东省郯城县，干燥过100目筛，供试品采用蒸馏水配制成264 mg/mL的混悬液。

1.1.2

银杏花粉发酵饮料供试品。由山东省农产品精深加工技术重点实验室自行研制，该发酵饮料的银杏花粉含量为50 mg/mL，乳酸菌活菌量为109 CFU/mL。

1.1.3

试验动物。SPF级昆明种小鼠，雌雄各半，年龄在3～4个月，体重18～22 g。供试鼠及饲料均由山东大学实验动物中心提供。饲养室温度20～25 ℃，自由进水、进食。鼠笼垫料及饮水壶每2 d更换并进行清洗，以保持清洁。

1.2方法

1.2.1大剂量预试验。取禁食（正常饮水）18 h的小鼠20只，随机分为银杏花粉组和银杏花粉发酵饮料组，每组雌雄各半。采用口服灌胃法，每组剂量为0.04 mL/g体重[7]，记录试验动物反应情况。

1.2.2最大给药量试验[8]。取小鼠60只，禁食12 h（不禁水），随机分为银杏花粉、银杏花粉发酵饮料、空白对照组3组，每组20只，雌雄各半。2个给药组按0.04 mL/g体重给小鼠灌胃相应药液，2次/d；空白对照组给予小鼠同等体积的蒸馏水灌胃。计算1 d内的给药量，进行急性毒性试验观察，连续观察14 d。期间每天观察并记录小鼠的饮食、活动、大小便及有无死亡等情况。观察期结束，将小鼠脱臼处死解剖，肉眼观察心、肝、脾、肺、肾、脑、胃、小肠等脏器的改变情况；并取小鼠胸腺、脾脏，电子天平称重，计算胸腺系数和脾脏系数，进行统计分析。

1.2.3数据分析方法。文中数据用平均值±标准差表示，采用SPSS 19.0软件进行显著性分析。

2结果与分析

2.1大剂量预试验

试验得出，给药后银杏花粉组和银杏花粉发酵饮料组的小鼠均活动自如，未发现明显异常反应，且无一死亡，说明银杏花粉及其发酵饮料的安全性高，同时不能测出急性毒性的LD50值，故按预试验的2倍剂量进行小鼠最大给药量试验。

2.2最大给药量试验结果

小鼠给药剂量及观察14 d的体重及死亡情况如表1所示。给药后小鼠活动自如，未发现明显异常反应，银杏花粉组给药后1只小鼠体重逐渐减轻，第5天死亡，解剖后发现小鼠肺部明显充血，其他脏器未见明显异常，灌胃操作时发现银杏花粉组药液浓度过高，并且银杏花粉不溶于水，灌胃时操作难度较大，需反复灌胃。所以该小鼠死亡的原因可能为反复操作引起了肺炎反应，应判定为意外死亡。其余小鼠全部存活，活动自如，毛发光滑，饮食正常，呼吸道、眼及口腔等处无异常分泌物，未发现任何中毒症状，体重均有增加。与空白对照组比较，银杏花粉发酵饮料组的雄性小鼠体重极显著增加（P<0.001）。14 d观察期结束，将小鼠脱臼处死解剖，肉眼观察心、肝、脾、肺、肾、脑、胃、小肠等脏器，均未见明显异常表现。

如上所述，在该1 d给药剂量下，除银杏花粉组1只小鼠意外死亡外，其他小鼠在观察期内均未发生死亡或中毒症状，活动、脏器等均未见异常。故试验采用的1 d给药剂量即为小鼠最大给药量。

银杏花粉最大给药量（g/kg体重）=（单只小鼠日给药量/小鼠平均体重）×1 000=21.1；

发酵饮料最大给药量（mL/kg体重）=（单只小鼠日给药量/小鼠平均体重）×1 000=80.0。

2.3银杏花粉及其发酵饮料对小鼠胸腺系数和脾脏系数的影响

胸腺是小鼠体内重要的免疫器官，胸腺系数指胸腺重量与体重的比值。脾脏是小鼠体内最大的淋巴器官，脾脏系数指脾脏重量与体重的比值。胸腺系数和脾脏系数的变化与机体免疫功能变化密切相关[9]。给药14 d后小鼠胸腺系数和脾脏系数结果见表2。与空白对照组相比，雌性小鼠组间的差异不显著，而银杏花粉组的雄性小鼠胸腺系数显著增加（P<0.05），银杏花粉发酵饮料组的雄性小鼠脾脏系数极显著增加（P<0.01）。由此提示，银杏花粉、银杏花粉发酵饮料对雄性小鼠具有一定的免疫增強作用。

3结论与讨论

该研究大剂量预试验结果表明，银杏花粉及其发酵饮料对小鼠无毒无害，安全性高，不能测出急性毒性的LD50值。最大给药量研究结果表明，1 d累计灌服银杏花粉21.1 g/kg体重、银杏花粉发酵饮料80.0 mL/kg体重剂量下，观察14 d，小鼠无明显异常反应。表明银杏花粉及其发酵饮料小鼠灌胃给药的最大给药量分别为21.1 g/kg体重和80.0 mL/kg体重，此最大给药量远高于可能摄入的最高剂量，初步说明银杏花粉及其发酵饮料对小鼠没有急性毒性作用。同时研究发现，银杏花粉及其发酵饮料的摄入能够增加雄性小鼠的胸腺系数和脾脏系数，提示其具有一定的免疫增强作用，而对雌性小鼠的免疫功能影响不显著，其免疫增强作用是否与性别激素有关，需开展进一步的研究。

参考文献

[1] 任浩，宿树兰，管汉亮，等.银杏花粉中核苷、氨基酸及无机元素的成分分析[J].中草药，2014，45（19）：2839-2843.

[2] 王国霞，曹福亮，汪贵斌，等.不同地区银杏花粉黄酮和内酯含量的差异性[J].南京林业大学学报（自然科学版），2007，31（3）：34-38.

[3] 徐澄梅，任浩，钱大玮，等.采用UPLC-TQ-MS同时测定银杏花粉24种资源性化学成分[J].中国中药杂志，2015，40（11）：2157-2162.

[4] 孙谨先.银杏花粉胶囊及其制备方法：200510130954.5[P].2006-08-30.

[5] 曹福亮，汪贵斌，陈颖，等.银杏花粉食品加工工艺的研究[J].林业科技开发，2005，19（4）：68-70.

[6] 裘纪莹，陈相艳，刘孝永，等.银杏花粉及其发酵饮料的总黄酮含量及总黄酮测定方法比较[J].江苏农业科学，2015，43（10）：371-373.

[7] 中华人民共和国国家卫生与计划生育委员会.食品安全国家标准 急性经口毒性试验：GB 15193.3—2014[S].北京：中国标准出版社，2014.

[8] 张宾，王予辉.常用动物实验操作指南[M].上海：上海中医药大学出版社，2007：204.

[9] 齐东江，徐阿曼.奥美拉唑对小鼠胸腺、脾脏免疫功能的影响[J].安徽医药，2015，19（9）：1665-1667.