响应面法优化多花勾儿茶果实多酚提取工艺及其抗氧化活性研究

姚姝凤 成江 刘小攀 唐克华 董爱文

摘要[目的]优化多花勾儿茶果实中多酚提取工艺，并以叶多酚为对照，考察其果实多酚体外抗氧化能力。[方法]运用Box-Behnken Design响应面法优化多花勾儿茶果实提取工艺，并通过测定其总抗氧化能力，清除DPPH·自由基、清除羟基自由基及超氧阴离子自由基清除率考察其抗氧化能力。[结果]最优条件：乙醇体积分数51.66% 、料液比1〖DK〗∶35、提取时间2.5 h，该条件下多花勾儿茶果实多酚的得率为5.684 0 mg/g。同条件下提取多花勾儿茶果实及叶的多酚，且均具有较强抗氧化能力。[结论]多花勾儿茶果实多酚具有一定清除自由基能力，开发前景广阔。

关键词多花勾儿茶；多酚；响应面优化法；抗氧化

中图分类号R284文献标识码A文章编号0517-6611（2017）05-0124-05

Abstract[Objective] The extraction conditions of total polyphenols from the fruits of Berchemia floribunda were optimized and the antioxidants activities were investigated with the leaves as comparison. [Method] The optimal conditions to achieve the maximum yield of polyphenols were determined by the BoxBehnken design response surface methodology and the antioxidant activities of the total polyphenols were evaluated in vitro by scavenging capabilities of DPPH radical， hydroxyl radical and superoxide radical and total antioxidant capacity. [Result] Under the optimized conditions： ethanol volume fraction 51.66%， solidliquid ratio 1〖DK〗∶35 and extraction time 2.5 h， the experimental total polyphenols from fruits were 5.684 0 mg/g. And the polyphenols from fruits and leaves under the same extraction conditions both have high antioxidant activities. [Conclusion] Total polyphenols from the fruits of B. floribunda have a certain free radical scavenging capacity with broad prospects for development.

Key wordsBerchemia floribunda；Polyphenol；Response surface methodology；Antioxidant

基金项目张家界市科技局科技计划项目（2015FJ1149）；吉首大学校级科研项目（15JDY018）。

作者简介姚姝凤（1991—），女，山西大同人，硕士研究生，研究方向：林产化学加工工程。*通讯作者，研究员，硕士生导师，从事资源植物开发与利用研究。

收稿日期2016-12-23

多花勾儿茶（Berchemia floribunda）系鼠李科勾儿茶属植物[1]，在湖南省分布广泛，野生资源丰富，大多分布于海拔 1 200 m以下灌丛、山路旁、林缘等地，具有较大开发利用价值[2]。该属植物为民间传统药用与茶用植物，其根、茎可入药，嫩叶可代茶。目前，已从该属植物中得到黄酮类、苷类等多种具有生物活性的成分[3]。多花勾儿茶具有止咳平喘、抑菌、保肝、抗肿瘤等多重功效[4]，具有很高的研究与应用价值。多酚具有很好的清除自由基能力，特別是其中的活性成分原花青素已为癌症、炎症、衰老等的防治提供了新的理论与方法，成为国内外的研究热点[5]。目前已有苹果多酚[6]、石榴多酚[7]、野樱桃多酚[8]、葡萄多酚[9]等的研究报道。茶多酚为良好的抗氧化剂，具有抗癌、抗衰老、抗辐射、降血脂等多重功效[10-11]，成为茶叶与茶饮料等保健品开发的重要指标。多花勾儿茶在民间主要以嫩叶做茶用，被誉为“观音茶”，其果实则很少被利用，处于自生自灭状态。笔者对多花勾儿茶果实多酚的提取方法进行了优化，并考察其体外抗氧化能力[12-13]，同时与叶中多酚含量及抗氧化能力进行比较，旨在为多花勾儿茶的进一步综合开发与利用提供科学依据。

1材料与方法

1.1试验材料

材料：试验用多花勾儿茶果实及嫩叶采自张家界市永定区天门山后的崇山。提取前将多花勾儿茶果实和叶于50 ℃烘干，粉碎过30目筛，密封备用。

标准品：没食子酸标准对照品（89.9%），中国食品药品检定研究院（ID：ECS9-AJWK）。

试剂：1，1-二苯基-2-苦基肼自由基（DPPH·），上海伊卡生物科技有限公司；无水乙醇、钨酸钠、磷钼酸、浓磷酸、碳酸钠、氯化钠、L-抗坏血酸（Vc）、三羟甲基氨基甲烷、焦性没食子酸、硫酸钴等化学试剂均为国产分析纯。

仪器设备：

AEG-220电子分析天平（日本）SHIMADZU，HH-6恒温水浴锅（富华仪器），KQ-250E超声波清洗器，GZX-9146 MBE 型数显鼓风干燥箱，PE-52AA旋转蒸发器，U-3900紫外分光光度计（日本）HITACHI。

1.2试验方法

1.2.1检测方法[14]及标准曲线绘制。

配制 0.1 mg/mL没食子酸标准溶液。用该标准溶液配成10、20、30、40、50、60、80 μg/mL的没食子酸溶液。Folin-Denis（FD）试剂配制及显色方法，具体步骤如下：分别吸取1.0 mL没食子酸溶液于10 mL容量瓶中，加入1.0 mL FD试剂，摇匀，再加入Na2CO3 2.0 mL，加蒸馏水定容至刻度線，室温放置1 h，以蒸馏水为对照，测定A760 nm值。以标准溶液浓度为横坐标，A760 nm值为纵坐标，绘制标准曲线。

1.2.2单因素试验。

选择乙醇-水溶液作为提取溶剂，准确称取多花勾儿茶果实1.000 g（平行3份），固定提取温度60 ℃，提取时间1.5 h，液料比1〖DK〗∶20，考察不同乙醇体积分数0、10%、30%、50%、70%、90%对多花勾儿茶果实多酚提取率的影响。固定乙醇体积分数50%，提取温度60 ℃，提取时间1.5 h，考察不同料液比1〖DK〗∶10、1〖DK〗∶15、1〖DK〗∶20、1〖DK〗∶25、1〖DK〗∶30、1〖DK〗∶35对多酚提取率的影响。固定乙醇体积分数50%，提取温度60 ℃，料液比1〖DK〗∶25，考察不同水浴提取时间0.5、1.0、1.5、20、2.5、3.0 h对多酚提取率的影响。固定乙醇体积分数50%，提取时间1.5 h，液料比1〖DK〗∶25，考察不同水浴提取温度：室温、40、50、60、70、80 ℃对多酚提取率的影响。水浴提取前室温下超声处理 20 min，提取过滤后的滤液稀释10倍，按“1.2.1”的方法显色，测定吸光值，考察最优条件。

1.2.3响应面优化试验。

依据单因素试验结果，选择乙醇体积分数、料液比和提取时间为优化因素，多酚得率为响应值，使用软件Design-expert 8.0.6采用BOX-Benhnken设计进行响应面优化试验，并建立二次回归模型。响应面优化试验的因素水平编码设计[15]见表1。

1.2.4粗多酚的制备与含量的测定。

分别以多花勾儿茶果实、叶为原料，按响应面优化试验预测的最优条件进行提取，获得的多酚粗提液经旋转蒸发脱去乙醇，得到浓缩液，稀释后测定粗多酚含量。

粗多酚含量=C·V /m × 100%

式中，C为比色管中总多酚的浓度（μg/mL）；V为按测定浓度稀释后的体积；m为果实、叶子粉质量。

1.2.5体外抗氧化能力的测定[16]。

1.2.5.1总抗氧化能力。采用普鲁士兰法测定多花勾儿茶果实和叶粗多酚不同浓度试样吸光度，并以VC作为阳性对照，每个浓度梯度设3个平行。吸光度越高，表示抗氧化性越好。

1.2.5.2清除DPPH·自由基能力[17]。

用95%乙醇配制质量浓度为2.0×10-2 mg/mL的DPPH·标准溶液（现用现配），

测定多花勾儿茶果实及叶粗多酚清除DPPH·自由基能力，VC作为阳性对照。按下式计算DPPH·清除率（y）：

式中，Ac为3 mL DPPH溶液 + 3 mL 蒸馏水的吸光度；As为3 mL DPPH 溶液+3 mL 样品液的吸光度；Ai为3 mL样液+3 mL 95%乙醇的吸光度。

安徽农业科学2017年〖SM）〗〖SM（W〗〖SM）〗

1.2.5.3清除羟基自由基能力[18]。

采用亚硝基R盐-Co3+ 褪色法测定多花勾儿茶果实及叶多酚清除羟基自由基能力，取洁净试管，依次加入下列溶液：2 mL pH 9.2 缓冲溶液，1 mL 0.50 mmol/L CoSO4 溶液，1 mL 1.56 mmol/L亚硝基 R 盐（以下简称 Nit-R）溶液，1 mL体积分数0.1% H2O2溶液，蒸馏水稀释至10 mL，摇匀，37 ℃恒温水浴反应 45 min，在波长412 nm 测定吸光度 Ab，同时测定不加 H2O2的体系的吸光度 A0。表观羟自由基产生量可用ΔA=A0-Ab表示。在体系中加 H2O2之前加入一定量的抗氧剂样品，测量其吸光度 As，同时测定以水代替过氧化氢的吸光值AS0，则表观羟自由基清除率：

1.2.5.4清除超氧阴离子自由基能力[19]。

采用邻苯三酚自氧化法测定多花勾儿茶果实及叶多酚清除超氧阴离子自由基能力。抗氧化体系：pH 7.3的Tris-HCl 缓冲液6.0 mL，抗氧化样品0.5 mL（37 ℃水浴10 min），25 mmol/L邻苯三酚盐酸溶液（PR）1 mL（提前37 ℃下预热）。混匀，反应4 min后，用0.5 mL浓盐酸终止反应，在320 nm处测定吸光度Ai，同时测定不加PR，以10 mol/L盐酸，测定样品本底吸光值Aj。以等体积pH为7.3的Tris-HCI 缓冲液作为空白吸光度（A0）。

2结果与分析

2.1标准曲线绘制

以没食子酸为标准品，采用Folin-Denis比色法760 nm下测定，绘制标准曲线（图1）。回归方程为y=0.008 5x+0.003 5（r=0.999 3），说明在0～80 μg/mL线性关系良好。

2.2单因素试验

2.2.1乙醇体积分数对多花勾儿茶果实多酚得率的影响。

从图2可见，乙醇体积分数在50%～70%时，多花勾儿茶果实多酚得率较高，但乙醇体积分数超过70%，得率反而下降。这是由于多酚本身的酚羟基结构使极性相对较大，乙醇比例过高影响了多酚的浸出。因此，以50%乙醇作为提取溶剂。

2.2.2料液比对多花勾儿茶果实多酚得率的影响。

从图3可见，在料液比为1〖DK〗∶30时，多花勾儿茶果实多酚浸出量基本达到饱和，液料比过低，多酚提取不充分，液料比过高，不仅增加成本，而且浓缩时间过长多酚易被氧化[20]。综合考虑多酚得率、溶剂成本等因素，确定料液比为1∶30。

2.2.3水浴时间对多花勾儿茶果实多酚得率的影响。

从图4可见，提取时间为2.0 h时多花勾儿茶果实多酚得率达到最大，达到饱和。超过2.0 h，得率反而下降。这可能是由于提取时间延长，使多酚发生了不同程度的分解。因此，确定提取时间为2.0 h。

2.2.4水浴温度对多花勾儿茶果实多酚得率的影响。

从图5可见，提取温度在60 ℃时多花勾儿茶果实多酚得率最大，温度继续升高，得率反而下降。這可能是由于多酚在高温下发生不同程度的分解和异构化[21]，且高温使多酚抗氧化活性降低[22]，浸出更多的杂质。因此，以60 ℃作为多酚提取的最佳温度，这与前人[23-25]研究结果一致。

2.3响应面优化试验结果响应面设计及结果见表2，对试验结果进行多元线性回归分析，拟合得到的多花勾儿茶果实多酚提取的数学模型：

式中，Y为多酚得率（mg/g），A为乙醇浓度（%），B为料液比，C为水浴时间（h）。

对回归方程进行方差分析，得到模型的P<0000 1，且失拟项P>0.05，表明数学模型拟合良好[26]。模型的调整确定系数R2Adj=0.980 2，相关系数R2=0.991 4，说明实际值与预测值具有较好的拟合相关性，该模型可以用来预测已知变量范围内的多酚得率[ 27-28]。

方程的总模型、液固比（B）（P<0.000 1）、提取时间（C）（P=0.004 9）、二次项乙醇浓度、液料比与乙醇浓度的交互作用（AB）（P=0.000 2）对多酚得率的影响极显著；而乙醇体积分数（A）对试验结果影响不显著。在所选取的各因素中，对结果的影响从大到小依次为液料比、提取时间、乙体积分数。

从图6可见，液料比和乙醇体积分数交互作用较大地影响响应抛物曲线位置，说明乙醇体积分数和液料比2个因素存在着较强的交互作用；而乙醇体积分数和提取时间存在的交互作用较弱；不同的提取时间和液料比几乎无交互作用。

通过Design-Expert软件分析，得出多花勾儿茶果实多酚提取理论最佳工艺条件：乙醇体积分数51.66 %、提取时间2.5 h、料液比1〖DK〗∶35。在该条件下多花勾儿茶果实多酚平均得率为5.684 0 mg/g，RSD为1.324，与预测粗提取率5676 5 mg/g吻合良好，说明该方程与实际情况拟合性良好。

2.4抗氧化能力

2.4.1总抗氧化能力。

从图7可见，总多酚浓度为5～400 μg/mL时，多花勾儿茶叶多酚与VC总抗氧化能力相差不大，而多花勾儿茶果实多酚总抗氧化能力较低。

2.4.2清除DPPH·自由基能力。

从图8可见，多花勾儿茶果实多酚清除自由基的能力与VC相差不大，叶中总多酚清除DPPH·自由基的能力均强于果实中多酚。

2.4.3清除超氧阴离子自由基。

从图9可见，总多酚浓度为5～400 μg/mL时，多花勾儿茶叶和果实多酚对超氧阴离子自由基均具有一定的清除能力，但清除能力与VC比较低，其果实多酚清除能力强于叶多酚。

2.4.4清除羟自由基能力。

赵艳红等[16]研究表明，采用亚硝基R盐-Co3+ 褪色法测定精密度与重现性良好。从图10可见，总多酚浓度为1～30 μg/mL时，多花勾儿茶叶和果实多酚对羟自由基均具有较强的清除能力，且与VC相差不大；总多酚含量高于40 μg/mL时，果实多酚提取物清除羟自由基能力高于VC。

3结论与讨论

（1）该研究以多花勾儿茶果实为原料，采用 Folin-Denis法测定其多酚含量，在单因素试验的基础上，采用Box-Behnken法优化提取工艺条件，建立了多花勾儿茶果实多酚提取的二次回归模型，且模型拟合良好。预测最佳提取工艺为乙醇体积分数51.66 %、料液比1〖DK〗∶35、提取时间2.5 h（提取温度为60 ℃）。用所选提取条件提取多花勾儿茶果实、叶多酚，测定多酚得率分别为5.684 0、52.707 0 mg/g。体外抗氧化能力结果表明，多花勾儿茶果实和叶多酚均具有较好的体外抗氧化功效，对超氧阴离子自由基清除中，果实多酚显示出比叶多酚更强的清除能力。

（2）多花勾儿茶果实多酚含量虽小于叶，多酚但果实多酚和叶多酚一样，也具有较强的抗氧化能力，且对于超氧阴离子自由基表现出比叶多酚更强的清除能力。民间多用嫩叶做茶，而果实未被开发利用，造成资源浪费，该研究结果表明，果实和叶多酚对不同自由基清除能力不同。因此，就茶的开发而言，果实和叶的复合茶可能会有更好的功效，这有待于进一步研究。

参考文献

[1] 中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志[M].北京：科学出版社出版，1987：106.

[2] 蔡萍，刘浩，万丹.等.湖南省多花勾儿茶资源调查研究[J].湖南中医药大学学报，2015，35（10）：27-29.

[3] 陈立，董俊兴.勾儿茶属植物化学成分及其生物活性研究进展[J].中草药，2006，37（4）：627-630.

[4] 魏鑫.多花勾儿茶的化学成分及生物活性研究[D].北京：中国协和医科大学，2007：13.

[5] 高婷.葡多酚的提取，纯化工艺及抗氧化性研究[D].长沙：中南大学，2013：4.

[6] 冉军舰.苹果多酚的组分鉴定及功能特性研究[D].杨凌：西北农林科技大学，2013：5.

[7] 李国秀.石榴多酚类物质的分离鉴定和抗氧化活性研究[D].西安：陕西师范大学，2008：25.

[8] C〖DD（-1〗〖HT8.〗'〖DD）〗UJICA N，AVIKIN K，JANKOVIC〖DD（-1〗〖HT8.〗'〖DD）〗 T，et al.Optimization of polyphenols extraction from dried chokeberry using maceration as traditional technique[J].Food chemistry，2016，194：135-142.

[9] 李建慧，马会勤，陈尚武.葡萄多酚抑菌效果的研究[J].中国食品学报，2008，8（2）：100-107.

[10] 陈宗懋.茶多酚类化合物抗癌的生物化学和分子生物学基础[J].茶叶科学，2003，23（2）：83-93.

[11] 中華人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.饮料中单宁的测定 分光光度法GB/T 27985—2011 [S].北京：中国标准出版社，2012.

[12] 陈小雷，胡王，周蓓蓓，等.天然抗氧化剂茶多酚对水产品的抗氧化研究[J].安徽农业科学，2016，44（1）：112-114.

[13] 郝玉民，李立祥，易昶寺，等.广玉兰花总黄酮提取及其抗氧化活性研究[J].安徽农业科学，2014，42（5）：1365-1367，1485

[14] 裘振宇，汤明礼，张旋，等.盐肤木叶多酚提取及抗氧化活性初探[J].林产化学与工业，2013，33（1）：107-112.

[15] 金东日，洪波，李宗亮，等.响应面法优化瓜蒌薤白汤总黄酮的提取工艺[J].食品工业科技，2014，35（7）：221-226.

[16] 赵艳红，李建科，李国秀.天然抗氧化物体外活性评价方法的优选与优化[J].食品科学，2008，29（6）：64-69

[17] 张明.几种体外抗氧化检测方法的评价研究[D].西安：陕西师范大学，2010.

[18] 郭亚力，李聪，欧灵澄，等.3 种分光光度法对天然抗氧化物质抗自由基性能的分析检测[J].分析试验室，2004，23（10）：43-48.

[19] 韩少华，朱靖博，王妍妍.邻苯三酚自氧化法测定抗氧化活性的方法研究[J].中国酿造，2009（6）：155-157

[20] 孙达旺.植物单宁化学[M].北京：中国林业出版社，1992.

[21] 鹿洋.茶多酚的提取纯化及其性质研究[D].天津：天津大学，2013.

[22] 蒋丽，王雪梅，全学军，等.不同提取方法对茶多酚理化性质的影响[J].食品科学，2010，31（14）：136-139.

[23] 杨皓彬，杨娜，柏雪，等.白茶中茶多酚提取工艺及抗氧化活性的研究[J].中国食品学报，2014，14（12）：24-31

[24] 王 慧，蒋莲芬，唐超，等.高山绿茶茶多酚提取工艺研究[J].安徽农业科学，2012，40（7）：4007-4009

[25] 王凯博，逢涛，陶丽红，等.废弃茶叶中茶多酚的超声波辅助提取及纯化工艺研究[J].云南农业大学学报（自然科学版），2016，31（5）：959-966.

[26] 陈卫航，谭美亭，张婕.响应曲面法优化莲房原花青素提取工艺研究[J].郑州大学学报（工学版），2012，33（2）：31-35.

[27] 黄萌萌，乔娟娟，邱亚玲，等.响应面法优化玄参提取工艺研究[J].药学与临床研究，2014，22（1）：34-38.

[28] ZUORRO A.Optimization of polyphenol recovery from espresso coffee residues using factorial design and response surface methodology[J].Separation and purification technology，2015，152：64-69.