LncRNA在宫颈癌组织中的表达谱变化及意义

陈干涛 杨 潇 程艳香

·基础研究·

LncRNA在宫颈癌组织中的表达谱变化及意义

陈干涛 杨 潇 程艳香

目的 研究宫颈癌组织中lncRNA的表达变化情况，为探讨lncRNA参与宫颈癌发生与发展提供分子依据。方法 取20例宫颈癌患者的宫颈癌组织和20例正常宫颈组织，应用高通量lncRNA芯片技术分别检测两组中lncRNA表达谱的变化情况，并应用qRT-PCR技术对结果加以验证。结果 与正常宫颈组织相比，宫颈癌组织中共有30586条lncRNA和13982条mRNA存在差异性表达，通过GO聚类分析表明，上调mRNA和下调mRNA分别参与多种不同的生物过程。通过进一步分析发现变化差异性最明显的10个lncRNA可能通过影响相应的mRNA来发挥其生物学功能。qRT-PCR 结果与芯片检测结果一致，提示4个lncRNA(BC008359,RP11-521B24.5,BRE-AS1,和RP11-229P13.15)在宫颈癌组织中发挥重要作用。结论 本实验阐述了宫颈癌组织中lncRNA的变化情况，为探讨lncRNA参与宫颈癌发生与发展以及治疗提供新的分子依据。

宫颈癌组织；lncRNA；高通量lncRNA芯片技术

(ThePracticalJournalofCancer,2017,32:523～527)

宫颈癌(cervical cancer)是最常见的妇科恶性肿瘤之一,仅次于乳腺癌，且宫颈癌发病呈年轻化趋势[1]。非编码RNA(Non-coding RNAs)是指不翻译为蛋白但是具调节作用的功能性RNA分子，包括siRNA、miRNA和长链非编码RNA(lncRNA)。lncRNA是一类长度超过200nt的RNA[2]。近年来由于测序技术的广泛应用，发现lncRNA通常存在于核内或细胞质中，广泛参与个体发育和生命过程的调控，并与疾病的发生发展密切相关。研究发现疾病状态下非编码RNA的表达存在差异，提示未来可将非编码RNA作为生物指标进行疾病诊断和预测[3-5],因此对其功能深入了解可作为肿瘤诊断和治疗的检测指标，且可迅速用于实际领域[3,6]。

本研究应用高通量lncRNA芯片技术检测20例正常宫颈组织和20例宫颈癌组织中lncRNA表达谱的变异，筛选出差异表达的lncRNA，进行聚类分析，筛选出与宫颈癌相关的lncRNA，为进一步阐明宫颈癌的发病机制提供实验依据，为临床治疗提供潜在的靶点。

1 材料与方法

1.1 标本收集

20例宫颈癌组织来自2015年1月至2015年6月在武汉市人民医院进行手术的宫颈癌患者；20例正常宫颈组织来自其他妇科手术患者，均证实为正常子宫组织。标本采集均经过患者家属签署知情同意书并经本医院伦理委员会审核通过。

1.2 材料

提取RNA的Trizol(Invitrogen公司)；反转录试剂盒和SYBR-Green Real-time PCR Master Mix试剂盒(ABI公司)；real-time PCR引物由TaKaRa公司设计并合成;Human lncRNA Microarrays V 3.0的芯片选择、探针设计、图像采集、数据分析等由上海康成生物公司完成。

1.3 芯片的选择

利用Arraystar公司所开发出的12×135k的lncRNA芯片，其覆盖目前NCBI Refseq、UCSC Known Gene、RNAdb，NRED等多个数据库的lncRNA种类。

1.4 探针设计

Arraystar lncRNA芯片设计的探针为60 met的长寡核苷酸，这些探针在高严格杂交条件下能够得到高灵敏度以及高特异性的理想实验结果。并且，针对每条序列都设计多条探针，增加了信号的可靠度。

1.5 组织样本总RNA的提取与检测

按照Trizol(Invitrogen)说明书，分别取120 mg的组织样本，按照试剂说明，分别从正常组织和宫颈癌组织抽提总RNA。通过紫外分光光度计测定吸光度值260、280、230 nm的吸收值，对总RNA进行计算浓度并评估纯度；同时结合甲醛变性凝胶琼脂电泳检测RNA纯度及完整性。

1.6 cDNA样品合成、标记和杂交

利用Invitrogen公司提供的cDNA合成试剂盒进行逆转录，合成双链互补DNA；利用Nimblegen公司的DNA标记试剂盒进行双链互补DNA的标记，使用分光光度计检测荧光标记效率，以保证后续芯片实验结果的可靠性；利用NimbleGen提供的杂化系统进行排列杂交，然后利用Nimblegen清洗液试剂盒进行清洗。

1.7 图像采集和数据分析

利用Agilent Microarray Scanner (Agilent p/n G2565BA)扫描芯片扫描荧光强度，然后将扫描图像输入Agilent Feature Extraction软件，以进行网格对齐与表达数据分析。通过分位数标准化以及Agilent Feature Extraction软件内将表达数据进行规范，后用Agilent Gene Spring Software软件分析。芯片选择，探针设计，图像采集和数据分析由上海康成生物完成。

1.8 Real-timePCR检测lncRNA变化

选差异性变化最大的lncRNA通过Real-timePCR 进行验证。采用ABI 7300荧光定量PCR仪，SYBR Green荧光染料(ABI公司)掺入法相对定量，同时以内参GAPDH为参照，计算差异表达的倍数。

2 结果

2.1 lncRNA表达芯片结果

将40个组织样本定量进行高通量lncRNA芯片杂交，检测宫颈癌组织与正常宫颈组织中lncRNA的表达谱，表达谱数据通过t检验分析，绘制散点图(Scatter Plot)，以差异倍数Fold>2倍且P<0.05为筛选条件，筛选出显著性差异表达的lncRNA(图1)。共检测出30586条lncRNA，进行聚类分析和比较后，发现差异表达的lncRNA共22043条。其中11545条表达上调，10498条表达下调，在所有的表达差异lncRNA 中，RP11-44K6.2表达上升倍数最多，为404.26倍；RP4-781K5.4为下降倍数最多的lncRNA,为-529.83倍。同时检测mRNA的表达情况，发现13982 个mRNA表达出现差异性变化，其中5867个表达上升和7115表达下降。在这些变化的mRNA中，SAA2为表达上升倍数最多(7784.59倍)的mRNA,而SERPINB3为下降倍数最多的mRNA(-6948.15倍)。

图1 lncRNA表达散点图

2.2 聚类分析获得参与宫颈癌的mRNA的相关功能和信号通路

基因本体论(gene ontology，GO)是基因功能国际标准分类体系，分为分子功能(Molecular Function)，生物过程(biological process)和细胞组分(cellular component)三部分。

通过GO聚类分析发现在宫颈癌组织中，上调mRNA(Fold>2)多与细胞膜成分相关，具有受体反应和离子通道等分子功能，参与了刺激反应，信号传导和细胞交流等生物过程(图2 A,B,C)；下调mRNA(Fold>2)与细胞膜细胞器成分相关，具有蛋白锚定和能量传递等功能，参与了核苷酸代谢，嘌呤代谢和核苷磷酸代谢等生物过程(图2 D,E,F)。参考KEGG Pathway，根据分子参与的功能，表达差异性变化的mRNA可能参与了钙信号转导，细胞内吞，细胞粘附和神经信号传导以及一些信号通路如MAPK，p53，Ras和Wnt等信号通路(图3)。

注：A,B和C代表上调mRNA的细胞过程,细胞组分和分子功能分析图；D,E和F代表下调mRNA的细胞过程,细胞组分和分子功能分析图。 图2 mRNA差异表达的Go分析图

注：左图为上调，右图为下调。 图3 上调和下调mRNA的通路分析图

2.3 lncRNA和mRNA共差异表达谱以及lncRNA功能预测

很多研究表明lncRNA能够通过影响mRNA表达情况来发挥其生物学功能。KEGG Pathway根据分子参与的功能，以Pathway Map形式展示每个通路中基因(蛋白质)、小分子等网络。对差异表达mRNAs进行通路分析以推断它们参与的通路。对此我们分析了变化差异性最明显的10个lncRNA，寻找出了与其变化密切相关的mRNA,这些lncRNA可能通过影响相应的mRNA来发挥其生物学功能，有可能成为研究宫颈癌的标志分子。

2.4 实时荧光定量RT-PCR结果验证芯片结论

为了验证芯片的结果，采用定量PCR法随机测定4个变化明显的lncRNA(BC008359,RP11-521B24.5,BRE-AS1,和RP11-229P13.15)在宫颈癌组织中表达情况。与正常组织相比，BC008359,RP11-521B24.5均出现了20倍以上的上升,而 BRE-AS1和RP11-229P13.15分别降低了70倍和25倍(图4)。上述结果表明，定量PCR结果与芯片检测结果一致，证明lncRNA芯片结果可靠。

图4 qRT-PCR检验lncRNA芯片

3 讨论

关于lncRNA在宫颈癌方面已经有很多研究，Gibb等检测了宫颈瘤变组织中lncRNA的差异表达，发现在CIN1，CIN2和CIN3期组织中lncRNA均有差异表达[7]。其激活和失活均能从分子水平调控肿瘤细胞的生长[8]。近年来测序技术的广泛应用，一些lncRNA逐渐被提出和发现。HOTAIR被发现在多种原癌组织中表达，Huang等检测了218例宫颈癌患者HOTAIR的表达，发现在癌变组织中存在高表达[9]，提示该分子可以作为宫颈癌诊断和转移的标记物[9-10]。王文玲等用PFLP检测发现，H19在宫颈癌组织中高表达，而在正常组织中不表达[11]，同时Vidal等发现上调H19可以促进宫颈细胞对HPV的易感性[12]。因此H19基因可以作为宫颈癌早期复发的标志物。此外P21，UCA1和MALAT-1也被发现在癌组织中高表达，提示癌细胞复发和转移的可能[13-15]。lncRNA芯片技术能快速高效地发现具有重要调控功能的lncRNA，逐渐成为lncRNA检测重要手段，将有助于开发新的癌症诊断和治疗方法。

本研究中我们借助Arraystar公司的lncRNA芯片，在临床中收集了20例宫颈癌组织和20例正常宫颈组织，分析两组lncRNA表达谱的变化。发现宫颈癌组织中差异表达的lncRNA共22043条。其中11545条表达上调，10498条表达下调。mRNA共13982个出现差异性变化，5867个表达上升和7115个表达下降。上调mRNA(Fold>2)多与细胞膜成分相关，具有受体反应和离子通道等分子功能，参与了刺激反应，信号传导和细胞交流等生物过程(图2 A,B,C)；下调mRNA(Fold>2)与细胞膜细胞器成分相关，具有蛋白锚定和能量传递等功能，参与了核苷酸代谢，嘌呤代谢和核苷磷酸代谢等生物过程(图2 D,E,F)，KEGG通路分析表明MAPK，p53，Ras和Wnt等信号通路很可能参与了mRNA的分子调控。很多研究证实，lncRNA的表达与mRNA表达水平具有密切关系，lncRNA能够通过影响mRNA表达情况来发挥其功能。我们着重分析了表达差异最高的10条lncRNA和mRNA共差异表达谱，发现无论上调和下调显著的lncRNA附近的功能性mRNA均有不同程度的表达上调和下调(Fold>2)，其中lncRNA RP11-534N16.1下调63倍对应的mRNA DSG1下调61倍，为这10条lncRNA中下调的mRNA倍率最高，后续研究将会进一步确定这两者的关系。同时，我们通过荧光定量PCR随机测定4个变化明显的lncRNA(BC008359,RP11-521B24.5,BRE-AS1,和RP11-229P13.15)进一步验证，也到相同的结论，提示这4个lncRNA在宫颈癌组织中可能发挥重要作用。目前，关于宫颈癌发病原因和机制，需要进一步研究。在本实验中，我们阐述了宫颈癌组织中lncRNA的变化情况，并找出与宫颈癌关系最密切的lncRNA分子，为探讨lncRNA参与宫颈癌发生与发展及治疗提供分子依据，我们将进一步对这些lncRNA进行研究，以期阐明这些差异表达的IncRNA在宫颈癌中的作用，寻找宫颈癌治疗的有效靶点。

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(编辑：吴小红)

Different Expression Profiles of lncRNA in Cervical Cancer Tissues and Its Significance

CHENGantao,YANGXiao,CHENGYanxiang.

RenminHospitalofWuhanUniversity，Wuhan，430060

Objective To investigate the changes of lncRNA in cervical cancer tissues,and provide molecular basis for investigating the occurrence and development of cervical cancer related with lncRNA.Methods 20 cervical cancer patients and 20 normal cervical tissues were selected.Applicated with high-through put microarray lncRNA,we tested the variation of lncRNA expression profiles of normal cervical tissues and cervical cancer tissues.The result was verified by real-time quantitative RT-PCR.Results Compared with normal cervical tissues,a total of 30586 lncRNA and 13982 mRNA were identified as differentially expressed in cervical cancer tissues.GO cluster analysis showed that up-regulated mRNAs and down-regulated mRNAs were associated with various biological processes respectively.The 10 lncRNA showed the most obvious difference analyzed to influence mRNA corresponding to exert its biological function.Quantitative PCR results were consistent with the microarray results suggested four lncRNA (BC008359,RP11-521B24.5,BRE-AS1,and RP11-229P13.15) played important roles in cervical cancer.Conclusion The changes of lncRNA in cervical cancer,and provide molecular basis for investigating the occurrence and development and the therapy of cervical cancer related with lncRNA.

Cervical cancer tissues;lncRNA;High-throughput microarray lncRNA

湖北省卫生厅项目(编号:2012Z-Y02)；湖北省卫计委一般面上项目(编号:WJ2015MB084)；国家自然科学基金项目(编号:81302273)

430060 武汉大学人民医院(陈干涛，杨 潇，程艳香)；430060 湖北省仙桃市第三人民医院(陈干涛)

程艳香

10.3969/j.issn.1001-5930.2017.04.001

R737.33

A

1001-5930(2017)04-0523-05

2016-05-20

2016-12-15)