金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和肺炎克雷伯杆菌多重PCR方法的建立与初步应用

祝岩波，郑 龙，尤红煜，王 璇，梁晓亮，刘健敏，张东明，连伟光，栗彦宁，王俊霞*

(1.河北省实验动物重点实验室，河北医科大学实验动物学部，石家庄 050000； 2.河北医科大学第二医院，石家庄 050000)

技术方法

金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和肺炎克雷伯杆菌多重PCR方法的建立与初步应用

祝岩波1，郑 龙1，尤红煜1，王 璇2，梁晓亮1，刘健敏1，张东明1，连伟光1，栗彦宁1，王俊霞1*

(1.河北省实验动物重点实验室，河北医科大学实验动物学部，石家庄 050000； 2.河北医科大学第二医院，石家庄 050000)

目的 建立金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和肺炎克雷伯杆菌多重PCR检测方法，为实验动物细菌检测提供快速、灵敏、简便的方法。方法 根据金黄色葡萄球菌nuc基因、绿脓杆菌LasI基因、肺炎克雷伯杆菌PhoE基因和细菌通用16S rRNA基因设计出特异性引物；经过多重PCR引物浓度和退火温度的优化，特异性和敏感性的检测，建立多重PCR体系。应用该PCR体系对人工感染标本、实验动物粪便样本进行验证检测,与传统检测方法对比。结果 多重PCR分别扩增出金黄色葡萄球菌(153 bp)、绿脓杆菌(600 bp)、肺炎克雷伯杆菌(368 bp)和通用(520 bp)的目的条带。多重敏感性为10 pg，特异性检测未从其他细菌中检测出目的条带。应用建立的多重PCR体系检测出不同组合的人工感染标本，从76只粪便检测出绿脓杆菌阳性1例,与传统检测方法结果一致。结论 本文建立的多重PCR方法具有特异、灵敏、简便、快速等优点，为实验动物微生物的快速检测提供了可靠的方法。

金黄色葡萄球菌；绿脓杆菌；肺炎克雷伯杆菌；多重PCR

金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，S．aureus)、绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa，P．aeruginosa)和肺炎克雷伯杆菌(Klebsiellapneumoniae，K．pneumoniae)均为人畜共患病的条件致病菌，是我国SPF级别实验动物大鼠、小鼠、豚鼠、地鼠、兔等必须排除的病原体。三种病原体在实验动物机体免疫功能低下、实验刺激等情况下，可能导致呼吸道和消化道等疾病，严重感染甚至造成动物死亡[1]。近几年实验动物质量监测结果显示，金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和肺炎克雷伯杆菌等条件致病菌阳性时有发生[2-4]。目前我国实验动物微生物等级及监测标准GB/T14926．13—2001，GB/T14926．14—2001，GB/T14926．17—2001，针对上述三种条件致病菌采用的是传统的分离培养和生化鉴定方法进行检测，此种方法费时费力，而且实验人员需要具备较高的专业素质。目前分子生物学方法对于细菌、病毒的检测已得到广泛应用，本研究探讨了多重PCR方法对上述三种细菌进行检测的方法，为建立快速、准确和简便的检测方法提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌株

本实验所用菌种金黄色葡萄球菌(ATCC6538)由石家庄市疾控中心惠赠，绿脓杆菌(CMCC10110)、多杀巴氏杆菌、支气管败血性波氏杆菌由中国食品药品检定研究院惠赠，肺炎克雷伯杆菌(CMCC46117)购自广东省微生物菌种保藏中心。支原体分离株，大肠杆菌，志贺菌，乙型溶血性链球菌本室保存。

1.1.2 动物样本

随机抽检来自河北省实验动物中心，河北医科大学第三医院和河北医科大学第四医院动物实验室的共计76只清洁级活体动物粪便样本及回盲部内容物，其中包含21只大鼠，36只小鼠，6只豚鼠，5只地鼠，8只兔。

1.1.3 引物

根据金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和肺炎克雷伯杆菌的特异性区域设计相应引物，引物基因、引物序列、产物长度和文献出处见表1。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.1.4 试剂

普通营养琼脂培养基，营养肉汤培养基，甘露醇氯化钠琼脂培养基(SP)，NAC液体培养基，NAC琼脂培养基，DHL琼脂平皿，血琼脂平皿，均购自北京三药科技开发公司；细菌基因组DNA提取试剂盒，粪便基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司。细菌生化鉴定管购自杭州天和微生物试剂有限公司； Mix购自康为世纪；Tris购自Solarbio公司；DNA Ladder购自南京诺唯赞生物科技有限公司；琼脂糖Agarose购自BIOWEST公司；核酸染料ExRed购自北京庄盟国际生物基因科技有限公司。

1.1.5 仪器

所用微量分光光度计为NanoDrop为基因公司；PCR仪为美国ABI 9700；凝胶成像系统为美国UVPGDS-8000。

表1 引物序列

1.2 实验方法

1.2.1 细菌DNA的提取

注：(A)M.100 bp DNA Ladder;1～4,金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯杆菌和绿脓杆菌引物浓度均为0.2 μmol/L,通用引物浓度分别为0.2 μmol/L,0.1 μmol/L,0.05 μmol/L,0.025 μmol/L;(B)M.100 bp DNA Ladder;1～4,退火温度分别56℃,58℃,60℃,62℃。图1 多重PCR引物浓度和退火温度的优化Note.(A)M.100 bp DNA Ladder;1～4, Staphylococcus aureus、Pseudomonas aeruginosa、Klebsiella pneumoniae primer concentrations is 0.2 μmol/L,universal primer concentration is 0.2 μmol/L,0.1 μmol/L,0.05 μmol/L,0.025 μmol/L;(B)M.100 bp DNA Ladder;1～4, annealing temperature is 56℃,58℃,60℃,62℃.Fig.1 Optimization of multiplex PCR in primer concentrations and annealing temperature

标准菌株复苏培养后，天根细菌基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，操作根据试剂盒说明进行。经紫外分光光度计检测，测取各菌株的浓度。

1.2.2 粪便DNA的提取

收集活体动物粪便用天根粪便基因组DNA提取试剂盒按照使用说明提取基因组DNA。

1.2.3 多重PCR反应体系和反应条件

PCR反应体系为50 μL，包括：Mix 25 μL，引物 6.5 μL(金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯杆菌和绿脓杆菌反应体系终浓度分别0.2 μmol/L，通用引物0.05 μmol/L)，DNA 3 μL。

反应条件为94℃ 5 min；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共30个循环; 72℃ 7 min。PCR产物在2.5% 琼脂糖凝胶中，120 V 电泳30 min。

1.2.4 特异性检测

用所建立的多重PCR体系分别扩增多杀巴氏杆菌，支气管败血性波氏杆菌，支原体分离株，大肠杆菌，志贺菌，乙型溶血性链球菌来检测所建方法的特异性。

1.2.5 敏感性检测

将金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯杆和绿脓杆菌的DNA按照1∶1∶1混合，并做10 倍系列稀释至10-5倍浓度，每种浓度取3 μL作为PCR反应模板，不同稀释浓度病原体模板质量分别为10 ng，1 ng，100 pg,10 pg,1 pg,100 fg，检验多重PCR的敏感性。

1.2.6 应用

将金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯杆菌和绿脓杆菌分别混入动物粪便中，提取粪便DNA，使用三种病原菌多重PCR方法扩增；收集21只大鼠，36只小鼠，6只豚鼠，5只地鼠，8只兔共76份动物粪便，提取粪便DNA，使用三种病原菌多重PCR方法检测，将阳性扩增产物测序，测序结果与Genebank公布序列进行比对。将回盲内容物根据国家标准的传统检测方法分离培养鉴定，将其结果与多重PCR结果进行比对。

2 结果

2.1 PCR引物浓度和退火温度的优化

分别对金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯杆菌和绿脓杆菌进行单重PCR实验，结果显示金黄色葡萄球菌扩增出153 bp产物，肺炎克雷伯杆菌扩增出368 bp产物，绿脓杆菌扩增出600 bp产物，细菌通用引物扩增出520 bp产物。多重PCR体系引物浓度优化，当3种病原菌引物浓度均为0.2 μmol/L时，比较通用引物浓度分别为0.2、0.1、0.05、0.025 μmol/L时扩增效果，结果显示通用引物浓度0.05 μmol/L时，四条扩增条带较均一清晰(见图1A)。多重PCR扩增体系退火温度优化，结果显示60℃退火温度时，四条扩增条带较清晰均匀(见图1B)。

2.2 特异性

用建立的多重PCR方法扩增多杀巴氏杆菌、支气管败血性波氏杆菌、支原体、大肠杆菌志贺菌和乙型溶血性链球菌，结果显示只出现一条细菌通用引物扩增目的条带，无其他阳性产物(见图2)。

注：(M)100 bp DNA Ladder；(1)阳性对照;(2)多杀巴氏杆菌；(3)支气管败血性波氏杆菌；(4)支原体;(5)大肠杆菌；(6)志贺菌；(7)乙型溶血性链球菌。图2 多重PCR特异性Note.(M)100 bp DNA Ladder;(1)Positive control；(2)Pasteurellamultocida；(3)Bordetella bronchiseptica;(4)Mycoplasma pneumoniae;(5)Escherichia coli;(6)Shigella;(7)β-hemolytic streptococcus.Fig.2 Specificity results of multiplex PCR

2.3 敏感性

三种病原菌金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯杆菌和绿脓杆菌多重PCR敏感性实验结果显示，每种病原菌DNA最低检测质量均为10 pg，见图3。

2.4 应用

注：(M)100 bp DNA Ladder；(1)阳性对照;(2)阴性对照；(3，8)正常粪便；(4，9)加金黄色葡萄球菌；(5，10)加绿脓杆菌；(6，11)加肺炎克雷伯杆菌；(7,12)加金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和肺炎克雷伯杆菌。图4 多重PCR的人工感染标本检测结果Note.(M)100 bp DNA Ladder;(1)Positive control；(2)Negative control；(3,8)Normal feces；(4,9)Staphylococcus aureus；(5,10)Pseudomonas aeruginosa；(6,11)Klebsiella pneumoniae；(7,12)Three bacteria.Fig.4 multiplex PCR detection results of artificial positive samples

使用多重PCR方法对人工感染的粪便DNA样本进行扩增，结果显示与预期结果一致，并无非特异性产物扩增(见图4)；用多重PCR体系对收集的76份动物粪便DNA检测，结果显示有一例样本在约600 bp处有一条扩增条带，与绿脓杆菌扩增产物条带大小相似(见图5)，送测序，测序结果与Genebank绿脓杆菌DNA 序列一致。

注：(M)100 bp DNA Ladder；(1～6)质量分别为10 ng、1 ng、100 pg、10 pg、1 pg、100 fg。图3 多重PCR敏感性Note.(M)100 bp DNA Ladder;(1～6)The quality is 10 ng, 1 ng, 100 pg, 10 pg, 1 pg, 100 fg.Fig.3 Sensitivity results of multiplex PCR

3 讨论

金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和肺炎克雷伯杆菌属于人畜共患病的病原菌，均属我国SPF级实验动物必须排除的病原菌。目前我国实验动物的金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和肺炎克雷伯杆菌的检测仍采用国家标准推荐的传统的分离培养方法和生化鉴定。该方法经典、准确，但操作繁琐，费时，实验条件限定和检测人员的主观判定使得该方法各检测室之间易出现结果的差异[2，3]。因此急需建立一种快速、准确的新检测方法。

金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和肺炎克雷伯杆菌PCR方法早已在微生物检测中应用，但之前方法每次只能检测一种细菌，检测效率低，工作量大，影响了广泛的应用[8]。本文根据金黄色葡萄球菌nuc基因、绿脓杆菌LasI基因、肺炎克雷伯杆菌PhoE基因和细菌通用16S rRNA基因设计出特异性引物建立了可以同时检测三种实验动物条件致病菌的三重PCR方法。并在反应体系中加入由16S rRNA基因设计的细菌通用引物，作为内质控，在病原菌检测中可以根据通用引物扩增条带的情况判定反应体系是否完好及评估体系中加入的模板质量。

注：A：(M)100 bp DNA Ladder；(1)阳性对照;(2)阴性对照；(3～12)小鼠粪便样本。B：(M)100 bp DNA Ladder；(1)阳性对照;(2)阴性对照；(3～12)小鼠粪便样本；(13～17)大鼠粪便样本。图5 多重PCR粪便样本检测结果Note.A：(M)100 bp DNA Ladder;(1)Positive control；(2)Negative control；(3～12)Fecal sample of mice.B:(M)100 bp DNA Ladder；(1)Positive control；(2)Negative control；(3～12)Fecal sample of mice；(13～17)Fecal sample of rats.Fig.5 Feces samples test results of multiplex PCR

在多重PCR条件的优化过程中，金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯杆菌和绿脓杆菌引物浓度均为0.2 μmol/L,通用引物浓度为0.2、0.1、0.05、0.025 μmol/L时，均可获得四条带，但在通用引物浓度为0.05 μmol/L时可获得更明亮均一的条带，在此引物浓度基础上，对退火温度优化，四个温度均可扩增出目的片段，但60℃最优，同时，其特异性和敏感性良好，因此可以达到一个比较满意的效果。

因三种病原体均存在于动物粪便中，考虑粪便DNA提取物可能影响多重PCR反应特异性，本研究将金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和肺炎克雷伯杆菌三种病原菌分别混入到动物粪便中，提取总DNA，多重PCR方法扩增结果与预期结果一致，能够准确的检测出不同的菌株组合，并且没有非特异性扩增。为了验证本方法在实际实验动物病原菌检测中应用性，在多家实验动物单位取材，取回盲内容物应用传统分离培养的检测方法，结果为一例绿脓杆菌感染阳性，同时取相应的实验动物的活体粪便，提取粪便DNA，使用多重PCR方法检测三种病原菌，结果显示在76份活体动物粪便中均可以扩增出通用条带，检测到一例绿脓杆菌感染阳性，与传统方法获得一样的结果，初步验证本方法的可行性。本文建立的多重PCR方法旨在活体检测，便于对活体动物进行长期的微生物监测，达到质量控制标准。总之，在下面工作中，将进一步扩大检测样本量验证本方法的准确性和实用性。

本方法有良好的重复性，操作简单、快速，成本较低，可以在实验动物微生物检测中进一步应用。

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Establishment and application of a multiplex PCR method inStaphylococcusaureus、PseudomonasaeruginosaandKlebsiellapneumoniae

ZHU Yan-bo1，ZHENG Long1,YOU Hong-yu1,WANG Xuan2,LIANG Xiao-liang1,LIU Jian-min1,ZHANG Dong-ming1，LIAN Wei-guang1,LI Yan-ning1,WANG Jun-xia1*

(1.Department of key laboratory Animal Hebei Province, laboratory Animal Hebei Medical University， Shijiazhuang 050000，China; 2.The Second Hospital of Hebei Medical University,Shijiazhuang 050000,China)

Objective Aiming at detectingStaphylococcusaureus、PseudomonasaeruginosaandKlebsiellapneumoniaein laboratory animals,the paper provides a rapid,sensitive and simple test method.Methods According toStaphylococcusaureusnucgene,PseudomonasaeruginosaLasIgene,KlebsiellapneumoniaPhoEgene and general 16S rRNA gene, designed specific primers ; Through the optimization of multiplex PCR primer concentrations and annealing temperature, the specificity and sensitivity of detection, establishing multiplex PCR system.Application of the PCR system test specimens of artificial infections and experiment animal feces is compared with traditional test method.Results Multiplex PCR amplification ofStaphylococcusaureus(153 bp),Pseudomonasaeruginosa(600 bp) withKlebsiellapneumoniae(368 bp) and general (520 bp).The multiplex sensitivity for the purpose of 10pg, specificity of detection was not detected from other pathogens.Application of establishing multiplex PCR system to detect the artificial positive samples, and detect 1Pseudomonasaeruginosapositive case in 76 fecals.Conclusions This paper established the multiplex PCR method which has the advantages of specific,sensitive,simple and rapid, and provides a reliable way for rapid test in laboratory animals microbiology.

Staphylococcusaureus;Pseudomonasaeruginosa;Klebsiellapneumoniae; Multiplex PCR

国家科技支撑计划(2015BAI07B02-05)。

祝岩波(1990-)，女，硕士研究生，专业：动物学。E-mail:787211186@qq.com

王俊霞(1962-)，女，教授，研究方向：从事微生物检验。E-mail:13333011022@163.com

R-33

A

1671-7856(2017) 05-0094-05

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.05.020

2016-11-28