黑小麦功能性低聚糖的分离与组成分析

孙元琳 仪 鑫 李云龙 陕 方 陈树俊

(运城学院生命科学系1 ，运城 044000)(山西大学生命科学学院2 ，太原 030006)(山西省农科院农产品综合利用研究所3，太原 030031)

黑小麦功能性低聚糖的分离与组成分析

孙元琳1仪 鑫2李云龙3陕 方3陈树俊2

(运城学院生命科学系1，运城 044000)(山西大学生命科学学院2，太原 030006)(山西省农科院农产品综合利用研究所3，太原 030031)

研究黑小麦麸皮功能性低聚糖的分离制备方法，并对其组成进行分析。采用木聚糖酶酶解黑小麦麸皮不溶性膳食纤维，所得酶解液经活性炭柱层析进行分离，并利用液相色谱和离子色谱对分离组分的单糖组成、低聚糖组成以及阿魏酰基团进行检测。结果表明，活性炭柱层析的水洗组分(WO)、不同浓度醇洗组分(EO)的低聚糖均主要由阿拉伯糖和木糖组成，为阿拉伯低聚木糖。其中，WO含有结合态阿魏酸，为阿魏酰低聚糖。WO的低聚糖聚合度较高，为DP 4～7；醇洗组分EO的低聚糖聚合度较低，为DP 2～4。

黑小麦 阿魏酰低聚糖 阿拉伯低聚木糖 活性炭柱层析

黑小麦麸皮是黑小麦加工的主要副产物，其膳食纤维含量丰富，主要为阿拉伯木聚糖、β-葡聚糖和纤维素等。黑小麦麸皮中还含有丰富的酚酸物质，如阿魏酸、芥子酸、香草酸等，其中阿魏酸的含量高于普通小麦麸皮中阿魏酸的含量[1]。利用木聚糖酶对麸皮不溶性膳食纤维进行可控性酶解，可作用于阿拉伯木聚糖链的β-1,4糖苷键，从而释放出阿魏酰低聚糖和阿拉伯低聚木糖[2]。

阿魏酰低聚糖和阿拉伯低聚木糖都属于功能性低聚糖，二者的主要区别在于，阿魏酰低聚糖还含有结合态阿魏酸。即在阿拉伯低聚木糖的基础上，其侧链阿拉伯糖基通过酯键与阿魏酸相连。低聚木糖是一种非消化性低聚糖，可直达大肠，能够增殖双歧杆菌，是一种有效的双歧因子；阿魏酸具有降血脂、抗血栓、抗菌消炎等功能[3]，也是一种有效的抗氧化剂，其衍生物糖酯具有更强的抗氧化活性[4]。阿魏酰低聚糖兼具阿魏酸和低聚木糖的功能特性，且因结构中特殊的酯键，增加了阿魏酸的水溶性，更有利于发挥其抗氧化作用，同时具有增殖有益菌、调节肠道菌群的作用[5]。

目前，低聚糖多采用凝胶柱层析技术，利用分子体积排阻原理将低聚糖按相对分子质量的不同进行分离，常使用的凝胶有Sephadex LH-20、Bio-Gel P-2[6]。阿魏酸糖酯的分离纯化普遍采用非极性大孔吸附树脂，如Amberlite XAD-2、Amberlite XAD-8 HP等[7]。这类树脂通过范德华力作用有效吸附酚酸类化合物，将含有苯环的阿魏酸糖酯与低聚糖进行分离。

活性炭作为一种非极性吸附剂，也可用于低聚糖的分离。从20世纪50年代，科学家开始进行活性炭层析吸附糖类的研究，Whistler等[8]研究得出聚合度高的糖需要更高浓度乙醇进行洗脱。石波等[9]也利用活性炭柱层析分离得到低聚木糖单一组分，但鲜有利用活性炭柱层析分离阿魏酸糖酯与低聚糖的相关报道。本试验利用活性炭对阿魏酰低聚糖和阿拉伯低聚木糖吸附力的不同，以及不同洗脱液对阿魏酰低聚糖和阿拉伯低聚木糖解析能力的不同，将二者进行有效分离，从而实现从一种黑小麦资源中同时制备得到2种不同组成的高附加值益生元产品，为黑小麦特色谷物资源的有效增殖和综合利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黑小麦麸皮：山西省农科院棉花研究所；木聚糖酶(EC3.2.1.8，酶活60 000 U/mg)：德国Ruibio公司；标准木糖、阿拉伯糖、阿魏酸：Sigma公司；标准低聚木糖(DP 2～7)：山东龙力生物科技有限公司；活性炭：天津市瑞金特化学品有限公司；50%氢氧化钠溶液：Sigma-Alorich公司；醋酸钠(固体)、氢氧化钾：美国Thermo Fisher Scientific公司；甲醇、冰乙酸、异丙醇(色谱纯)：天津市大茂化学试剂厂。

1.2 仪器与设备

BS-100A型自动部分收集、DHL-A型电脑恒流泵：上海沪西分析仪器厂；LC1200型高效液相色谱仪、Cary5000紫外-可见-近红外分光光度计：美国Agilent公司；ICS-5000型离子色谱仪：美国Dionex公司。

1.3 试验方法

1.3.1 黑小麦阿魏酰低聚糖及阿拉伯低聚木糖酶解液的制备

将黑小麦麸皮粉碎，称取800 g粉碎后的麸皮，在121 ℃下进行高压蒸汽处理45 min。将处理过的黑小麦麸皮悬浮于6 000 mL水中，加入耐温α淀粉酶、糖化酶、中性蛋白酶以去除淀粉和蛋白质，高温灭酶后，离心(3 000 r/min，15 min)，弃去上清液，沉淀依次用热蒸馏水、无水乙醇洗涤，弃去上清液，将沉淀真空干燥，得到黑小麦麸皮不溶性膳食纤维[10]。称取10 g不溶性膳食纤维，加入200 mL pH 4.8醋酸-醋酸钠缓冲溶液以及3.1 mg木聚糖酶，在46 ℃下酶解22 h。酶解结束后于沸水浴中灭酶10 min，加入3倍体积的无水乙醇，静置过夜，于3 000 r/min离心15 min，得到富含阿魏酰低聚糖和阿拉伯低聚木糖的酶解液。

1.3.2 活性炭柱层析

将酶解液均匀地加在已平衡好的活性炭柱(2.6 cm×30 cm)层析，依次用蒸馏水、10%、20%、40%、60%、80%乙醇为洗脱液进行洗脱，洗脱速度为1.5 mL/min，每管4 mL分部收集，逐管检测糖含量(苯酚-硫酸法A480 nm)，绘制洗脱曲线。分别收集水洗及不同浓度醇洗组分。

1.3.3 薄层层析

分别将木糖、低聚木糖标准品、洗脱组分用微量进样器进行点样，然后放于充满展开剂蒸气的层析缸中，采用上行法进行展开，展开结束后用喷雾器将显色剂均匀喷洒在薄层板上，于105 ℃下显色10 min。展开剂：V乙酸乙酯∶V甲醇∶V蒸馏水∶V氨水=5∶9∶1∶1.5；显色剂：苯胺-二苯胺-磷酸[11]。

1.3.4 低聚糖组成分析

离子色谱条件：采用CarboPac PA200色谱柱，检测器为安培检测器，柱温30 ℃，150 mmol/L NaOH等度洗脱，流速为0.4 mL/min，进样量25 μL。样品与标准品(阿拉伯糖、木糖、低聚木糖)进样前用0.45 μm的微孔滤膜过滤。

1.3.5 单糖组成分析

称取低聚糖样品3～5 mg，水洗组分及不同浓度醇洗合并组分分别溶于2 mL 2 mol/L三氟乙酸溶液，在100 ℃下水解2 h，除尽过量的三氟乙酸，定容至30 mL[11]，进样离子色谱。根据出峰时间判断单糖种类，根据峰面积的比值确定各单糖间的比例关系。色谱条件：色谱柱为CarboPac PA20柱，检测器为安培检测器，柱温30 ℃，10 mmol/L KOH等度洗脱，流速为0.4 mL/min，进样量25 μL，样品与标准品(阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、半乳糖)进样前用0.45 μm的微孔滤膜过滤。

1.3.6 紫外扫描

分别将标准品阿魏酸与样品(水洗组分及醇洗合并组分)溶于100 mmol/L pH 6.0的MOPS缓冲液中，进行紫外光谱扫描，扫描波长范围为190～400 nm。

1.3.7 阿魏酰基团的检测

用乙酸乙酯萃取洗脱液，重复萃取3次，合并有机相，挥干其中的有机溶剂后，用1 mL甲醇复溶，此样品为洗脱液中的游离态阿魏酸。萃取后的水相用2 mol/L NaOH酯解后，用6 mol/L HCl调节pH至2.0，浓缩后用乙酸乙酯重复萃取3次，合并有机相，挥干有机溶剂，用1 mL甲醇复溶，此样品为结合态阿魏酸[3]。将游离态和结合态阿魏酸样品进行HPLC测定。

色谱条件：C18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流动相为甲醇-2%乙酸；梯度洗脱：0～10 min 0.5%→5.0%，10～20 min 5.0%→20.0%，20～40 min 20.0%→50.0%，40～48 min 50.0%→80.0%，48～55 min 80.0%→0.5%；柱温为室温；流速1.0 mL/min；检测波长320 nm；进样量20 μL。

2 结果与分析

2.1 活性炭柱层析洗脱曲线

不溶性膳食纤维酶解液的活性炭柱层析洗脱曲线见图1。用蒸馏水、10%、20%、40%、60%、80%乙醇进行洗脱，可以得到6个洗脱峰。收集单一峰组分并浓缩，对其进行薄层层析、低聚糖组成分析、单糖组成分析、紫外全波长扫描及阿魏酰基团检测。

图1 酶解液的活性炭柱层析洗脱曲线

2.2 薄层层析

图2为活性炭柱层析各洗脱组分的薄层层析结果。酶解液含有聚合度为DP 2～7的低聚糖，也含有部分聚合度大于7的低聚糖；酶解液经活性炭柱层析所得到水洗组分中低聚糖的聚合度较高，而不同浓度醇洗组分中低聚糖的聚合度较低。其中，EO-10和EO-20的低聚糖主要由DP 2和DP 3组成，EO-40、EO-60及EO-80的低聚糖除了DP 2和DP 3外，还含有DP 4、DP 5以及聚合度更高的低聚糖。水洗组分及不同浓度醇洗组分低聚糖的聚合度的不同，是由于在水溶液中，活性炭的吸附低聚糖的能力最强，此时水洗脱得到的是不能被活性炭吸附的低聚糖；在以乙醇溶液为洗脱剂时，可以将活性炭吸附的低聚糖洗脱下来，是因为活性炭的吸附能力随着在乙醇溶液中会减弱，且吸附能力随着乙醇浓度的升高而减弱，也就是说随着乙醇浓度的升高，其洗脱能力随之增强，将聚合度大的低聚糖洗脱下来的能力也增强，因此在40%、60%、80%的乙醇洗脱组分中高聚合度低聚糖的含量高于10%、20%乙醇洗脱组分。

注：1 木糖，2 低聚木糖(DP 2～7)，3 酶解液，4 WO，5 EO-10，6 EO-20，7 EO-4O，8 EO-60，9 EO-80。图2 活性炭柱层析各洗脱组分的薄层层析图谱

2.3 低聚糖组成分析

采用离子色谱对活性炭柱层析洗脱组分的低聚糖组成进行分析，其中水洗组分WO和60%醇洗组分EO-60的离子色谱如图3所示。WO中低聚糖的聚合度较大(DP 4～7)，而不同浓度乙醇洗脱组分中低聚糖的聚合度较低(DP 2～4)，此结果与薄层层析结果一致。各洗脱组分中低聚糖的含量如表1所示。由表1可以看出，WO中低聚糖的聚合度主要为DP 4、DP 5和DP 7；醇洗组分中木糖质量分数随着乙醇浓度的升高而逐渐降低，分别由33.94%降至2.71%，至EO-80中已不含木糖。而DP 2、DP 3、DP 4的含量均随着乙醇浓度的升高而相对增加。其中，DP 2质量分数升至77.53%后有小幅降低，主要是由于其他组分DP 3、DP 4的含量在升高。

图3 活性炭柱层析水洗组分(WO)与60%醇洗组分(EO-60)的低聚糖离子色谱图

表1 活性炭柱层析洗脱组分的低聚糖组成/%

2.4 单糖组成分析

采用离子色谱对活性炭柱层析组分的单糖组成进行测定。从图4可以看出，WO、EO均由阿拉伯糖和木糖组成，此外，还含有少量葡萄糖和半乳糖。由表2可知，WO中各单糖的物质的量比为阿拉伯糖∶木糖∶葡萄糖∶半乳糖=1∶1.89∶0.12∶0.05，EO中各单糖的物质的量比为阿拉伯糖∶木糖∶葡萄糖∶半乳糖=1∶3∶0.33∶0.03。WO、EO的分支度(A/X)分别为0.53和0.33，其中WO 的A/X较高，可以为阿魏酸基团的连接提供更多的取代位点。

图4 活性炭柱层析水洗组分(WO)与醇洗组分(EO)的单糖离子色谱图

表2 活性炭柱层析洗脱组分的单糖组成

2.5 紫外光谱分析

分别对MOPS缓冲液中的标准品阿魏酸、活性炭水洗组分WO及醇洗组分EO进行紫外波长扫描，结果如图5所示。图5显示，在MOPS缓冲液中，标准阿魏酸和水洗组分WO均在286和325 nm附近有强吸收。其中，标准品阿魏酸在286 nm处有最大吸收，而WO在325 nm处有最大吸收，由此推断活性炭水洗组分中有酯化的阿魏酸存在[12]。图5显示，活性炭醇洗组分EO在紫外区无吸收，说明EO中不含阿魏酸。

图5 活性炭水洗组分(WO)和醇洗组分(EO)的紫外光谱

2.6 阿魏酰基团检测

对活性炭柱洗脱组分中的游离态、结合态阿魏酸进行高效液相色谱检测。由图6可知，水洗组分WO中的阿魏酸主要以结合态形式存在，而游离态阿魏酸未检出(图略)，因此，其低聚糖为阿魏酰低聚糖。醇洗组分EO中的游离态、结合态阿魏酸均未检出(图略)，表明EO低聚糖中不存在阿魏酰基团。经计算，WO中的阿魏酰基团含量为42.78 mg/g。

图6 活性炭柱水洗组分(WO)中结合态阿魏酸的HPLC图谱

3 结论

采用木聚糖酶酶解黑小麦麸皮不溶性膳食纤维，所得酶解液经活性炭柱层析得到水洗组分(WO)和不同浓度醇洗组分(EO)。WO的低聚糖聚合度较高，为DP 4～7。不同浓度EO的低聚糖聚合度主要为DP 2～4，其含量随着乙醇浓度的升高而相对增加。对水洗组分及醇洗合并组分的阿魏酰基团及单糖组成进行分析，WO中含有结合态阿魏酸，是阿魏酰低聚糖，其中阿魏酰基团含量为42.78 mg/g。EO中不存在结合态阿魏酸，是阿拉伯低聚木糖；WO和EO的低聚糖均主要由阿拉伯糖和木糖组成，WO分支度(A/X=0.53)高于EO(A/X=0.33)，这也为阿魏酰基团的连接提供了更多的取代位点。

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Isolation and Composition Analysis of Functional Oligosaccharides from Black-Grained Wheat

Sun Yuanlin1Yi Xin2Li Yunlong3Shan Fang3Chen Shujun2

(Department of Life Science,Yuncheng University1, Yuncheng 044000)(College of Life Sciences,Shanxi University2, Taiyuan 030006)(Institute of Farm Products Comprehensive Utilization，Shanxi Academy of Agricultural Sciences3, Taiyuan 030031)

Functional oligosaccharides from black-grained wheat were isolated and composition analyzed. The insoluble dietary fiber (IDF) of black-grained wheat was hydrolyzed by xylanase, and the hydrolyzate was isolated by activated charcoal column chromatography. The oligosaccharide, monosaccharide composition and ferulic acid group of the fractions were analyzed with liquid chromatography and ion chromatography. The results showed that the water elution fraction WO and the different concentration of ethanol elution fraction EO were mainly composed of arabinose and xylose, which were arabinoxylooligosaccharides. WO was feruloylated oligosaccharides containing conjugated ferulic acids. WO has a high degree of polymerization with 4～7, while the DP of EO was lower with 2～4.

black-grained wheat; functional oligosaccharides; activated charcoal column chromatography

国家自然科学基金(31101244)，山西省自然科学基金(2012011031-1),山西省高校研究生教改项目(2015JG16)

2015-09-08

孙元琳，女，1971年出生，教授，农产品加工与综合利用

S38

A

1003-0174(2017)05-0007-06