β-石竹烯通过作用于HMGB1/TLR4/NF-κB通路减轻小鼠局灶性脑缺血再灌注损伤①

杨 梅 安瑞娣 李明航 田晓翠 徐 露 董 志

(重庆医科大学药学院 重庆市生物化学与分子药理重点实验室，重庆400016)

β-石竹烯通过作用于HMGB1/TLR4/NF-κB通路减轻小鼠局灶性脑缺血再灌注损伤①

杨 梅 安瑞娣 李明航 田晓翠 徐 露②董 志

(重庆医科大学药学院 重庆市生物化学与分子药理重点实验室，重庆400016)

目的：研究β-石竹烯(β-caryophyllene,BCP)对脑缺血再灌注损伤(Cerebral ischemia-reperfusion，CIR)小鼠的保护作用及可能的机制。 方法：将C57BL/6 小鼠随机分组为假手术组(Sham)、模型组(CIR)、β-石竹烯组(62、124、248 mg/kg)。采用线栓法建立小鼠CIR损伤模型，缺血1 h，再灌注24 h后，进行神经行为学评分和脑梗死体积测定；TUNEL法观察CIR后缺血区神经细胞的死亡情况；Western blot 法检测脑组织中TLR4和NF-κB(p65)蛋白表达情况；免疫组织化学法检测缺血侧脑NF-κB(p65)的表达；ELISA 法检测CIR小鼠血清中HMGB1和缺血侧脑组织中IL-1β、TNF-α的含量变化。 结果：与模型组相比，BCP(248 mg/kg)可明显改善小鼠神经功能，减少脑梗死体积，降低缺血区神经元的死亡率(P<0.01)；降低血清中HMGB1浓度、TLR4的蛋白表达量(P<0.01)，抑制炎症通路NF-κB的激活并减少TNF-α、IL-1β的释放(P<0.01)。 结论：BCP能够减轻CIR诱导的小鼠脑组织损伤，其保护作用可能是通过抑制HMGB1/TLR4/NF-κB介导的炎症反应。

β-石竹烯;缺血再灌注损伤;炎症;TLR4;HMGB1

脑缺血是最常见的脑血管疾病，具有极高的发病率、致残率和致死率[1]。目前，采用溶栓法恢复缺血区血流灌注是脑缺血的主要治疗策略，但因其具有严格的时间限制，易引起脑缺血再灌注损伤(Cerebral ischemia-reperfusion injury,CIRI)[2]。越来越多研究表明，高迁移率族蛋白1(High mobility group protein box 1,HMGB1)参与CIRI的病理生理过程，并发挥了重要的作用[3]。在缺血再灌注条件下，HMGB1可从坏死的细胞中被动释放或从激活的胶质细胞中主动分泌,作为一种损伤相关分子模式，识别细胞表面TLR4受体并与之结合，介导炎症反应的发生。

β-石竹烯(β-caryophyllene,BCP)是一种双环倍半萜烯[4]，具有强大的抗炎活性，抑制炎症级联反应[5]。研究表明，BCP 能减少大鼠CIR损伤后的脑梗死体积[6]，但其潜在机制有待于进一步阐明。本实验拟建立小鼠CIR损伤模型，并给予BCP干预，观察BCP对CIR损伤后小鼠的神经功能、神经细胞死亡以及HMGB1/TLR4/NF-κB炎症通路的影响，探讨其可能的保护作用机制。

1 材料与方法

1.1 药品材料、试剂 β-石竹烯(纯度>80%)、2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)购自美国Sigma-Aldrich公司；TLR4、NF-κBp65抗体购自中国Proteintech 公司；TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒购自中国Vazyme公司； ELISA试剂盒购自美国USCN公司；SP免疫组化检测试剂盒购自中国中杉金桥公司；蛋白印迹其他相关试剂由中国碧云天公司提供。

1.2 实验方法

1.2.1 实验动物与分组 雄性C57BL/6 小鼠(20～25 g)75只，SPF级，由重庆医科大学实验动物中心提供(许可证号:SCXK 渝 2012-0001)。将C57BL/6 小鼠随机分组为假手术组(Sham)、模型组(CIR)、β-石竹烯组(62、124、248 mg/kg)。β-石竹烯用聚氧乙烯蓖麻油(10%，生理盐水)配制，以0.1 ml/kg容量连续7 d灌胃给药。Sham组和CIR组给以相同溶剂(10%聚氧乙烯蓖麻油灌胃)。

1.2.2 小鼠脑缺血再灌注模型的建立 参照Sugo等[7]，采用大脑中动脉栓塞法建立小鼠CIR损伤模型。用3%的水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠，仰卧固定，在手术显微镜下分离右颈总动脉(CCA)、颈内动脉(ICA)、颈外动脉(ECA)分支，结扎ECA、CCA，动脉夹夹住ICA,用显微镜从CCA剪一切口，插入直径为0.18 mm线栓，缓缓推入线栓进入ICA入颅分支，线栓穿过距ICA、CCA分叉处约0.85 mm，有阻力感后停止进入，固定线栓，缺血1 h后，缓缓将线栓拔出恢复血流，再灌注24 h。假手术组与模型组相同操作(除不插入线栓入ICA外)。

1.2.3 神经行为学评分 再灌注24 h后，采用Longa等[8]5分制评分标准对不同处理的小鼠进行神经行为学评分。

1.2.4 脑梗死体积测定 缺血再灌注24 h后，小鼠麻醉直接取脑，置于-20℃冰箱冰冻10 min，以视交叉为起点冠状切为连续5片(1 mm)，置于2%的TTC染色液中37℃避光孵育20 min。孵育结束后，脑切片中梗死区域因脱氢酶活性下降不能反映呈苍白色，非梗死区呈现红色，将脑切片置于4%多聚甲醛溶液中固定后用数码相机拍照。运用图像分析软件 Image-Pro Plus 5.1分析TTC染色脑切片梗死面积，并根据切片厚度计算脑梗死体积。

1.2.5 TUNEL法检测缺血侧神经细胞死亡情况 缺血再灌注24 h 后，麻醉小鼠，从心尖部(左心室)灌注生理盐水使流出液清亮，再灌注4%多聚甲醛至小鼠全身僵硬，断头取脑，于4%多聚甲醛中外固定12 h，再分别于20%、30%蔗糖溶液中梯度脱水，包埋于OCT中，-80℃保存。冰冻切片机连续冠状切片[厚度为5 μmol/(Lol·L)]，-20℃。取冰冻切片按TUNEL试剂盒说明书进行神经元死亡检测。在荧光显微镜下观察，只有凋亡的细胞核因掺入FITC-12-dUTP 而显绿色荧光。每张切片采集12个具有代表性的视野(200倍)，采用图像分析软件Image-Pro Plus计算其死亡阳性率。

1.2.6 Western blot法检测TLR4和NF-κB(p65)的表达 缺血再灌注24 h后，断头取脑，液氮速冻，按说明书提取缺血侧半脑的总蛋白并测定其含量，各组蛋白经12% SDS-PAGE 进行电泳分离，切胶，用湿法转移至PVDF 膜上，5%的脱脂牛奶封闭2 h后加入一抗TLR4(1∶ 200)、NF-κB(p65)于4℃孵育过夜。用TBST洗膜(4×5 min)后，采用三步法，生物素标记二抗结合，再采用辣根过氧化物酶标记的Streptavidin检测。洗膜后，采用增强化学发光液进行曝光显影。应用Image Lab图像分析软件分析条带光密度值，以GAPDH为内参，计算蛋白的相对表达量。

1.2.7 免疫组织化学法检测缺血侧脑组织NF-κB(p65)的表达 缺血再灌注24 h 后，按1.2.5项下操作进行灌流、外固定，再于酒精梯度脱水，二甲苯透明，浸蜡，包埋，切片(5 μm)。取切片烤片，二甲苯脱蜡，酒精梯度水化；0.01 mol/L的枸橼酸钠进行抗原修复，H2O2甲醇溶液避光孵育30 min，PBS清洗，山羊血清封闭，滴加NF-κB(p65)一抗(1∶50)，4℃孵育过夜；复温，PBS清洗，加生物素标记的二抗室温孵育30 min，滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液室温孵育30 min。DAB显色，脱水上行，中性树胶封片，显微镜观察并拍照。

1.2.8 ELISA 法检测脑组织中炎症因子(TNF-α、IL-1β)和血清中HMGB1的含量 取缺血侧脑组织匀浆后和取处理好的血清，按ELISA试剂盒说明书步骤进行操作。

2 结果

2.1 BCP减轻CIR损伤诱导小鼠神经功能缺损和降低脑梗死体积 与假手术组相比，模型组的神经行为学评分升高，出现较严重的神经行为功能缺失。与模型组相比，BCP组可降低由脑缺血再灌注引起的小鼠神经行为学缺失；缺血1 h，再灌注24 h后，小鼠缺血侧脑半球出现大面积的梗死(约36.83%)。而BCP组可减少梗死区域，梗死体积分别为30.52%、19.5%、11.69%。结果表明BCP能减轻小鼠缺血再灌注后损伤，其中BCP(248 mg/kg)药效最佳(表1)。

2.2 BCP对CIR损伤诱导的小鼠脑组织神经细胞死亡的影响 假手术组几乎无凋亡细胞，而CIR后，小鼠缺血侧脑出现大量的凋亡细胞，细胞核呈绿色荧光(图1)。与模型组相比，BCP(248 mg/kg)组凋亡细胞明显减少。

2.3 BCP对小鼠CIR后血清中HMGB1含量的影响 与假手术组相比，模型组血清中HMGB1浓度明显增加(图2)。与模型组相比，BCP(248 mg/kg)组能减低CIR后血清中HMGB1的含量。 各组HMGB1浓度见表2。

GroupsDose(mg/kg)Neurologicalscore(n=12)infarctvolume(n=3)Sham0±00±0CIR2.67±0.651)36.83±2.681)BCP622.17±0.5730.52±1.921241.75±0.512)19.50±1.212)2481.58±0.622)11.69±0.952)

Note：1)P<0.01，vs Sham；2)P<0.01，vs CIR.

GroupsDose(mg/kg)HMGB1(ng/ml)TLR4/GAPDHp-NF-κB/GAPDHSham5.18±0.950.31±0.030.59±0.07CIR46.4±4.391)0.62±0.061)1.22±0.101)BCP24813.4±3.292)0.38±0.042)0.76±0.092)

Note：1)P<0.01，vs Sham；2)P<0.01，vs CIR.

2.4 BCP对小鼠CIR缺血侧脑TLR4 蛋白表达的影响 与假手术组相比，模型组缺血侧脑组织中的TLR4的蛋白水平表达明显增加(图3)。与模型组相比，BCP(248 mg/kg)组能减低TLR4的蛋白表达。各组TLR4相对表达量见表2。

2.5 BCP对小鼠CIR缺血侧脑NF-κB蛋白表达的影响 模型组NF-κB通路明显激活,NF-κB p65(S536-p)的磷酸化水平明显增加(图4)；与模型组相比，BCP组明显减少p-NF-κB(p65)的含量，抑制NF-κB的激活；各组p-NF-κB相对表达量见表2。BCP(248 mg/kg)抑制CIR后的NF-κB(p65)核移位(图5)。

2.6 BCP对小鼠缺血侧脑组织中炎症因子的表达的影响 模型组缺血侧脑组织中促炎因子(TNF-α、IL-1β)含量升高。BCP(248 mg/kg)能明显降低因CIR损伤后炎性因子(TNF-α、IL-1β)的升高。结果见图6。

图1 BCP对小鼠CIR损伤后神经细胞死亡的影响Fig.1 Effects of BCP treatment on cell death in mice brain induced by CIRNote: Scale bar 200 μm.

图2 BCP对小鼠CIR后血清中HMGB1含量的影响Fig.2 Effects of BCP treatment on serum HMGB1 levels in mice subjected to CIRNote: **.P<0.01.vs sham，##.P<0.01，vs CIR.

图3 BCP对小鼠缺血侧脑组织TLR4 蛋白表达的影响Fig.3 Effects of BCP treatment on protein levels of TLR4 in mice ischemic brain induced by CIR

图5 BCP对小鼠缺血侧脑组织NF-κB通路的影响Fig.5 Effects of BCP treatment on NF-κB in mice ischemic brain induced by CIRNote: Scale bar 100 μm.

3 讨论

脑缺血再灌注损伤是一个复杂的病理生理过程，炎症在其中发挥了重要的作用。CIR损伤后，缺血区神经元细胞坏死，释放细胞因子、HMGB1等炎性介质；在这些因素的作用下，缺血区脑组织中小胶质细胞激活，白细胞浸润，进而释放更多的炎性介质，加重脑组织损伤，导致更多的神经元死亡[9，10]。本实验结果表明，BCP处理能明显减少小鼠CIR损伤诱导的神经元死亡和减轻炎症反应。

HMGB1是一种非组蛋白核蛋白，参与调控基因的转录和DNA重组等[11]。在机体损伤或细胞坏死条件下，HMGB1从细胞核移位至胞浆，从坏死的细胞或活化的胶质细胞中释放到细胞外，HMGB1可作为一种损伤相关分子模式与相应的受体识别结合，发挥其生物学效应[12]。HMGB1的受体主要有高级糖化终末产物受体(Receptor for advanced glycation end-products,RAGE)以及Toll样受体(Toll like receptors,TLRs)[13]。与HMGB1相关的TLRs包括TLR2、TLR4。在中枢神经系统中，HMGB1于神经元、星形胶质细胞中均有表达[14]。研究表明，HMGB1在CIR损伤过程中发挥了很重要的作用。

图4 BCP对小鼠缺血侧脑组织NF-κB通路的影响Fig.4 Effects of BCP treatment on NF-κB in mice ischemic brain induced by CIR

图6 BCP对小鼠CIR后缺血侧脑组织炎性因子(TNF-α、IL-1β)含量的影响Fig.6 Effects of BCP treatment on TNF-α and IL-1β levels in mice ischemic brain induced by ±s，n=6)Note: *.P<0.01,vs Sham；#.P<0.01 vs CIR.

Kim等[15]利用RNA干扰沉默HMGB1的表达能减轻脑中风损伤。Mori等[16]通过静脉注射抗HMGB1单克隆抗体能明显减少脑缺血的梗死体积。本实验结果显示BCP能够降低CIR损伤后血清中HMGB1的含量。

研究证明HMGB1在诱导细胞因子释放和促炎过程中的主要受体是TLR4[17]。TLR4是一种模式识别受体，与之内源性配体HMGB1结合后，激活核转录因子NF-κB等信号通路，促使炎症因子的表达。另外，有研究表明TLR4与脑缺血后损伤和炎症反应密切相关[18]。本实验结果显示，BCP能明显降低TLR4的蛋白表达水平，抑制NF-κB通路的激活，减少炎性因子的分泌。结果表明BCP能通过抑制TLR4/NF-κB通路减轻炎症反应。BCP是许多重要挥发油的组成成分，存在多种植物当中，如肉桂、丁香等[19]。BCP是一种CB2受体激动剂，具有广泛的药理活性[19]，包括抗癌、抗氧化及抗炎作用。Gertsch 等[20]证明，BCP能够抑制炎症级联反应，减少炎症因子的表达。另有研究证明，BCP对脑缺血大鼠有神经保护作用，可显著减少大鼠CIR后脑梗死面积[6]，减低神经行为学评分，其机制与减少线粒体功能紊乱，减少细胞内氧化应激，以及增加脑源性神经营养因子等相关[21]。但是BCP对CIR损伤的保护机制还有待于进一步研究。本实验研究显示，BCP(124、248 mg/kg)能明显改善CIR损伤后小鼠的神经功能缺陷，能减少脑梗死体积。其中BCP(248 mg/kg)的效果最佳。BCP能减少缺血区神经细胞死亡，降低血清中HMGB1浓度，减少TLR4蛋白表达，抑制NF-κB通路的激活，减轻炎症反应，对小鼠CIR损伤有一定的保护作用。

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[收稿2016-12-28 修回2017-03-17]

(编辑 许四平 刘格格)

β-caryophyllene mitigates cerebral ischemia reperfusion injury in mice by inhibiting HMGB1/TLR4/NF-κB pathway

YANGMei,ANRui-Di,LIMing-Hang,TIANXiao-Cui,XULu,DONGZhi.

ChongqingKeyLaboratoryofBiochemistryandMolecularPharmacology,SchoolofPharmacy,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China

Objective:investigate the effect of β-caryophyllene(BCP)on cerebral ischemia-reperfusion(CIR)injury in mice.Methods: Mice were subjected to CIR with or without BCP(62,124,248 mg/kg).At 24 h of reperfusion,ischemic degrees were determined according to neurologic dysfunction score and cerebral infarct volume.The protein expression of Toll-like receptor(TLR)4 was measured by Western blot.Nuclear factor κB(NF-κB)p65 were measured by immunohistochemistry and Western blot.IL-1β,tumor necrosis factor-α(TNF-α)and serum high-mobility group box 1(HMGB1)levels were measured by ELISA kit.Results: Compared to the CIR group,BCP(248 mg/kg)reduced the neurological score and cerebral infarct volume.BCP reduced neuronal death in mice brain subjected to cerebral I/R.In addition,BCP also inhibited the activation of NF-κB pathway and decreased increases in TLR4,HMGB1,TNF-α,IL-1β levels by CIR(P<0.01).Conclusion: BCP protects mice brain against CIR injury,its neuroprotective mechanisms may involves HMGB1/TLR4/NF-κB pathway.

β-caryophyllene;Ischemia-reperfusion injury;Inflammation;Toll-like receptor 4;High-mobility group box 1

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.07.011

杨 梅(1993年-)，女，在读硕士，主要从事神经药理学方向的研究。

及指导教师：董 志(1960年-)，男，博士，教授，主要从事神经药理学方面的研究，E-mail：dongzhi5904@163.com。

R965

A

1000-484X(2017)07-1009-05

①本文为重庆市自然科学基金重点项目(KJ1600235, CSTC20 16jcyjA0258)。

②通讯作者，E-mail: xulu8792@163.com。