Th17/Treg比率在慢性乙型肝炎患者外周血的动态变化及意义①

胡亚南 单永业 罗亚文

(遵义医学院附属医院感染科，遵义563000)

Th17/Treg比率在慢性乙型肝炎患者外周血的动态变化及意义①

胡亚南 单永业②罗亚文

(遵义医学院附属医院感染科，遵义563000)

目的：通过比较不同治疗方法对慢性乙型肝炎(Chronic hepatitis B ，CHB)患者外周血Th17(T helper lymphocyte 17)、Treg(regular T cell)细胞频率及Th17/Treg比率的变化，探讨其在CHB患者疾病转归中的意义。方法：CHB患者40例，根据保肝治疗基础上是否加用核苷酸抗病毒药物分为未抗病毒治疗组(Chronic hepatitis B without antiviral，CHBWA)20例、抗病毒治疗组(Chronic hepatitis B antiviral，CHBA)20例、乙肝病毒携带者(Asymptomatic hepatitis B carriers ，AsC)10例、健康对照组(Health control，HC)10例；采用流式细胞术检测CHBWA组0月、1月及CHBA组0月、1月、3月，AsC患者和HC外周血Th17、Treg细胞频率，计算Th17/Treg比率，观察其在疾病不同阶段的动态变化。结果：CHBWA组保肝治疗1月后，Th17/Treg比率(0.39±0.11)比0月(1.20±0.26)明显降低(P<0.01)，已接近AsC组(0.39±0.14)及HC组(0.42±0.20)Th17/Treg比率水平(P>0.05)，且Th17/Treg比率与ALT有良好的正相关关系(r=0.709，P=0.000)；在CHBA组，Th17/Treg比率在1月(0.73±0.32)、3月(0.76±0.44)均较0月(1.18±0.27)明显下降，与0月比较差异有统计学意义(P<0.01)，但继续治疗到3月时Th17/Treg比率较1月时变化不明显，Th17/Treg比率在0、1、3月均高于AsC组及HC组(P<0.01，0.05)；Th17/Treg比率与ALT、HBV DNA有良好的正相关关系(r=0.500，P=0.000；r=0.345，P=0.007)；两组间比较，0月时两组间Th17/Treg比率差异无统计学意义(P>0.05)，但经治疗1月后CHBA组Th17/Treg比率高于CHBWA组(t=4.471，P<0.01)。结论：CHB患者中，抗病毒治疗将迅速影响Th17、Treg细胞频率，导致Th17/Treg比率的变化，其变化可能与清除病毒有关。

慢性乙型肝炎 ；Th17；Treg；Th17/Treg

2014年对乙型肝炎的流行病学调查显示，全球仍有约2.4亿慢性乙型肝炎(Chronic hepatitis B ，CHB)病毒(Hepatitis B virus ，HBV)感染者，且每年约有65万患者死于HBV感染所致的肝功能衰竭、肝硬化、肝癌[1]。有效治疗乙肝，仍是世界的难题[2]。对于乙型肝炎病毒持续感染机体的机制目前仍不清楚，目前已有的研究中较为肯定的是乙肝病毒感染机体后引起人体抗病毒免疫功能异常是导致HBV持续感染的主要原因[3]，但其确切的免疫学机制仍未完全明确。既往研究表明：与同属CD4+T 细胞亚群作用相反的Th17(T helper lymphocyte 17)、Treg(regular T cell)细胞和慢性HBV感染有关，故Th17/Treg的失衡与CHB患者病情发展及病毒清除关系更为密切[4]，Th17细胞作为典型的促炎细胞，在HBV感染患者中，促进炎症反应及肝细胞损伤[5]，Treg细胞在免疫调节中，主要起抑制免疫作用，在HBV感染后免疫应答中Treg细胞主要是抑制机体清除病毒[6]，无论是Th17还是Treg细胞，在病情的进展过程中，常相互制约共同发挥作用。目前研究表明，相对于健康人群，CHB患者体内存在Th17/Treg比率的失衡，且这种失衡在慢性乙肝的发生、发展、转归中起着重要作用[7]。但对其在临床尤其是抗病毒治疗中的应用尚需系统观察，本文对是否进行抗病毒治疗的两组CHB患者Th17、Treg细胞频率、Th17/Treg比率变化观察，比较上述指标在治疗方法不同的两组间的变化，进一步探讨抗病毒治疗对Th17、Treg细胞频率及Th17/Treg比率变化的影响，为进一步优化CHB抗病毒治疗提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 临床资料 入选患者为2013年9月至2014年9月遵义医学院附属医院收治确诊临床CHB患者40例，均为HBsAg(Hepatitis B surface antigen)阳性持续超过6个月，此次出现肝炎症状和(或)体征，肝功异常患者。根据治疗方法随机分为两组：①慢性乙型肝炎未抗病毒组(Chronic hepatitis B without antiviral,CHBWA)：20例，其中男15例，女5例，平均年龄(28.35±10.17)岁，HBeAg(Hepatitis Be antigen)(+)15例，HBeAg(-)5例，慢性轻度1例，慢性中度17例，慢性重度2例，入院后仅予“异甘草酸镁注射液(天晴甘美)、还原性谷胱甘肽等”常规保肝、降酶及退黄治疗，采集0、1月清晨空腹静脉血各一次；②慢性乙型肝炎抗病毒组(Chronic hepatitis B antiviral,CHBA)：20例，其中男18例，女2例，平均年龄(36.65±8.88)岁，HBeAg(+)15名，HBeAg(-)5例， 慢性轻度1例，慢性中度14例，慢性重度5例，除常规保肝治疗外加用核苷类抗病毒治疗，其中18例服用恩替卡韦，2例服用拉米夫定抗病毒治疗，采集抗病毒治疗0、1、3月清晨空腹静脉血各1次。乙肝病毒携带者(Asymptomatic hepatitis B carriers， AsC)10例，均为HBsAg阳性持续超过6个月，未出现肝炎症状和(或)体征，肝功正常且未用任何保肝及抗病毒药物患者，其中男7例，女3例，平均年龄(39.00±5.29)岁。同期我院门诊体检健康者(Health control，HC)10例，为HBsAg阴性，肝功正常，既往无肝炎病史，其中男5例，女5例，平均年龄(26.40±4.67)岁。采集清晨空腹静脉血一次。四组年龄及性别构成差异均无统计学意义(P>0.05，见表1)。入选患者诊断符合2010年修订的《慢性乙型肝炎防治指南》的诊断标准[8]，并排除其他病原体感染以及因药物、酒精、放射线等物理因素引起的急、慢性肝炎和自身免疫性肝炎、肝脏占位性病变。本研究开始前已获取我院伦理委员会批准并争取到所有受试者的知情同意。

GroupsSex(male/female)Age(years)ALT(U/L)AST(U/L)HBV-DNA(lgcopies/ml)CHB18/236.65±8.881)469.65±434.511)310.05±516.331)5.75±1.541)CHBWA15/528.35±10.171)481.75±488.571)296.10±310.491)6.26±1.351)AsC7/339.00±5.2926.90±9.0723.30±11.207.19±0.85HC5/526.40±4.6720.40±6.4511.70±1.25-

Note：1)vs HC and AsCP<0.01.

1.1.2 检测材料 CD127-别藻青蛋白、IL-17-APC、CD8-异硫氰酸荧 光 素、CD4-FITC、CD3-藻红蛋白-花色素5.5、CD25-PerCP-Cy5.5单克隆抗体及同型对照均购自美国 eBioscience 公司；RPMI1640 培养液购自美国 HyClone 公司。佛波酯、布雷菲德霉素 A、莫能霉素、离子霉素、红细胞裂解液、破膜剂、固定液均购自中国杭州联科生物公司。

1.2 方法 外周血 Th17、Treg 细胞频率的检测：取入选研究对象新鲜外周血和 RPMI1640 培养液各250 μl混匀，加入佛波酯(12.5 μg/ml)、离子霉素(0.25 mg/ml)、布雷菲德霉素A(0.75 mg/ml)、莫能霉素(0.35 mg/ml)后于 37.0℃ 5%CO2浓度培养箱中放置并培养 4 h ；取培养后的全血细胞200 μl，向管1中加入 CD8-FITC 抗体5 μl和CD3-PerCP-Cy5.5 抗体5 μl进行细胞表面染色，于暗室室温孵育 15 min ；固定洗涤和破膜洗涤后，加入 IL-17-APC 抗体 5 μl 进行细胞内染色，设同型对照管室温暗室孵育 15 min 后洗涤，加入磷酸盐缓冲液 500 μl重悬细胞；向管 2 中加入CD25-PerCP-Cy5.5 抗体、 CD4-FITC 抗体、CD127-APC 抗体各 5 μl，设同型对照管室温暗室孵育 20 min 后，加入红细胞破膜剂 100 μl 室温暗室孵育 10 min，洗涤后，用磷酸盐缓冲液 500 μl 重悬细胞，于 24 h内流式细胞仪(购自美国 Beckman 公司)检测。HBV DNA、HBeAg 和肝功能的检测由本院检验科完成。

2 结果

2.1 CHB患者不同时期Th17、Treg细胞频率及Th17/Treg比率的变化见表2。

2.2 CHBWA组患者外周血Th17、Treg频率、Th17/Treg比率的动态变化结果 保肝治疗后随着ALT的下降，1月时Th17细胞频率较0月明显下降，但Treg细胞频率变化不明显，故Th17/Treg比率迅速下降，与0月比较差异有统计学意义(P<0.01)，已接近AsC及HC组水平(P>0.05)；0月时HBV DNA(1.27×107±1.78×107)拷贝/ml，保肝治疗1月HBV DNA(3.46×106±1.31×106)拷贝/ml，无明显下降；但Th17/Treg比率与ALT的相关性比较发现两者有良好的正相关关系(r=0.709，P=0.000)，见表2。

2.3 CHBA组患者外周血Th17、Treg频率、Th17/Treg比率的动态变化结果 0、1、3月Th17细胞频率迅速下降，而Treg细胞频率也逐渐下降，组间比较差异有统计学意义(P<0.01)，抗病毒治疗1月时HBV DNA明显下降至(5.32×103±1.88×104)拷贝/ml，3月时HBV DNA下降至(5.50×102±4.62×102)拷贝/ml，随着HBV DNA载量的下降，Th17/Treg比率也逐渐下降，3月时Th17/Treg比率与0月比较差异有统计学意义(P<0.01)，0、1、3月Th17/Treg比率均高于HC组(P<0.05)。进一步分析Th17/Treg比率变化与ALT和HBV DNA的相关性发现其与ALT、HBV DNA均有良好的正相关关系(r=0.500、0.345、P=0.000、0.007)。见表2。

2.4 CHBWA与CHBA组间外周血Th17、Treg细胞频率、Th17/Treg比率比较 0月时两组间外周血Th17、Treg细胞频率、Th17/Treg比率差异无统计学意义(P>0.05)，但经治疗1月后CHBA组Th17细胞频率高于CHBWA组(t=3.469，P<0.01)，Treg细胞频率低于CHBWA组(t=-4.588，P<0.01)，故CHBA组Th17/Treg比率高于CHBWA组(t=4.471，P<0.01)，见表2。

GroupsnDatesTh17TregTh17/TregCHBWA200month12.78±2.1910.77±1.711.20±0.261month3.84±0.971)10.06±1.530.39±0.111)CHBA200month12.56±2.4510.73±0.751.18±0.272)3)1month4.86±0.901)4)7.36±2.141)4)0.73±0.321)2)3)4)3month4.12±1.421)6.04±1.661)0.76±0.441)2)3)AsC10-4.47±1.3812.01±2.050.39±0.14HC10-0.68±0.291.62±0.180.42±0.20

Note：1)vs 0 monthP<0.01,2)vs HCP<0.01,3)vs AsCP<0.01,4)vs CHBWA 1mP<0.01.

3 讨论

感染HBV后是否慢性化及肝损伤与多种因素有关，众多的研究认为与机体抗HBV免疫状态最相关。已有研究发现，在HBV感染者中Treg细胞水平与细胞毒性T细胞CTL(Cytotoxic T cell)表达呈负相关[9]，Treg细胞具有抑制免疫反应功能，而与之功能相反的Th17细胞，已被证实具有促炎作用，参与了肝损伤过程[10]，Th17/Treg的失衡，普遍存在于肝脏相关的疾病如急性乙型肝炎、慢性乙型肝炎、肝衰竭、肝癌患者中[7,11-13]，与疾病发生、发展有关，但与CHB患者病毒清除的关系并不十分明确。

为进一步观察在CHB患者中核苷(酸)类药物抗病毒疗效与Th17/Treg比率的关系，我们将在保肝治疗基础上是否加用核苷(酸)类似物抗病毒分为CHBWA及CHBA组，动态观察发现：CHBWA组保肝治疗1月，随肝功能的恢复，Th17细胞频率明显下降，而Treg细胞频率无明显变化，故Th17/Treg比率较治疗前下降，且接近AsC及HC组水平，与治疗前比较有统计学意义，将Th17/Treg比率变化与ALT行相关性分析发现呈正相关关系，以上研究提示CHB患者Th17/Treg的下降可能是因为HBV感染相关免疫反应的减轻，这种变化有利于肝功能的恢复，由于未抗病毒，1月时HBV DNA基本无变化故未行相关性比较。在CHBA组，治疗1月不但肝功能恢复，HBV DNA亦明显下降， 在1、3月时Th17细胞频率迅速下降， Treg细胞频率逐渐下降，故Th17/Treg比率也逐渐下降，相关性分析发现Th17/Treg比率与ALT有良好的正相关关系，与HBV DNA亦呈正相关关系，提示抗病毒药物在清除病毒的过程中，病毒的减少可能会使机体的免疫抑制状态得到一定程度的恢复，而抗病毒的疗效也可能与Th17/Treg比率变化有一定的关系。进一步比较CHBWA组及CHBA组治疗前及治疗1月后Th17、Treg及Th17/Treg比率，发现治疗前Th17、Treg及Th17/Treg比率两组间均无统计学意义，但在治疗1月后上述指标在两组呈现不同的变化趋势：Th17频率均呈下降趋势，但CHBWA组下降更明显，而Treg细胞频率的变化在CHBA组下降更明显，故治疗方法不同的两组患者Th17/Treg比率均成下降趋势，但CHBWA组Th17/Treg比率明显低于CHBA组，CHBWA组在1月时Th17/Treg比率已接近免疫耐受期的AsC组，CHBA组在1月时Th17/Treg比率仍高于AsC组，提示CHB患者经有效的抗病毒治疗随着HBV DNA的下降，Th17/Treg比率仍呈现免疫效应细胞占优势的状态，这种状态可能有利于与抗病毒治疗一起发挥协同清除病毒的作用，以上研究表明不同的治疗方法带来Th17/Treg比率的不同变化，这种变化有利于病毒的清除；CHBA组继续抗病毒3月Th17/Treg比率的变化较1月时并不明显，提示Th17/Treg比率的迅速下降更有利于病毒清除，但由于随诊困难，本研究未继续同期比较CHBWA患者3月时Th17/Treg比率的变化。

综上所述，保肝治疗中虽肝功能恢复但HBV仍持续感染的CHBWA患者，Th17/Treg比率迅速下降至AsC及HC组水平虽对肝损伤恢复有利，但不利于病毒的清除，在加用抗病毒治疗的CHBA患者Th17/Treg比率虽有下降，但高于CHBWA组，且在1、3月Th17/Treg比率仍高于AsC及HC水平，提示抗病毒中可使CHB患者较长期处于免疫效应细胞占优势的状态是有利于清除病毒的。

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[收稿2017-01-05 修回2017-02-05]

(编辑 许四平 刘格格)

Dynamic changes and significance of peripheral blood Th17/Treg in chronic hepatitis B patients

HUYa-Nan,SHANYong-Ye,LUOYa-Wen.

DepartmentofInfectiousDiseases,AffiliatedHospitalofZunyiMedicalCollege,Zunyi56300,China

Objective:To investigate the significance of T helper type 17 cells(Th17)/T regulatory cells (Treg) in the prognosis of chronic hepatitis B(CHB) by comparing the changes of Th17 cells ,Treg cells and their rate under different therapy in chronic hepatitis B patients.Methods: 40 patients infected with chronic hepatitis B(CHB) were divided into chronic hepatitis B without antiviral(CHBWA) group and chronic hepatitis B antiviral(CHBA) group depending on whether nucleoside antiviral was applied,with 20 cases each，10 cases in asymptomatic hepatitis b carriers(AsC) group.10 cases in health control (HC) group.Flow cytometer(FCM) was adopted to detect peripheral blood Th17 and Treg cell frequency in CHB patients at 0,1 month in CHBWA group ,at 0,1,3 month in CHBA group,AsC patients and HC cases ,then calculating Th17/Treg ratio and observing the dynamic changes at different disease states.Results: After the liver-protecting treatment in CHBWA patients,the Th17/Treg ratio at 1 month(0.39±0.11)decreased compared to 0 month(1.20±0.26)rapidly(P<0.01),and the ratio nearly reached the level of AsC and HC group (P>0.05).Ratio of Th17/Treg and ALT had good positive correlation (r=0.709,P=0).In CHBA patients group,after the liver-protecting and antiviral treatment,patients′ Th17/Treg ratio decreased rapidly in the first month(0.73±0.32) and third month(0.76±0.44),and there′s statistical difference compared with 0 month(1.18±0.27,P<0.01),but there was no significant change of Th17/Treg ratio after being treated for 3 months compared with 1 month,and the Th17/Treg ratios at 0,1,3 month were higher than that in AsC group and HC group(P<0.01).Ratio of Th17/Treg and ALT have good positive correlation (r=0.500,P=0.000),also the ratio of Th17/Treg and HBV DNA were positively correlated (r=0.345,P=0.007).Comparison of peripheral blood Th17,Treg cells frequency,Th17/Treg ratio between CHBWA and CHBA group at 0 month had no statistical significance(P>0.05),while the Th17/Treg ratio in CHBA group was higher than CHBWA group(t=4.471,P<0.01) after 1 month of treatment.Conclusion: In the CHB patients,antiviral treatment will influence the Th17,Tregs cells frequency,resulting the change of Th17/Treg ratio,but also the ratio may be associated with virus removal.

Chronic hepatitis B;Th17;Treg;Th17/Treg

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.07.024

胡亚南(1991年-)，女，在读硕士，主要从事乙型肝炎免疫发病机制方面的研究,Email:luoyw719@163.com。

及指导教师：罗亚文(1971年-)，男，硕士，主任医师，硕士生导师，主要从事病毒性肝炎的免疫发病机制与临床研究，E-mail:luoyw719@163.com。

R512.6

A

1000-484X(2017)07-1072-04

①本文为贵州省科技厅社会发展攻关项目(No.黔科合SY字[2011]3048)。

②甘肃省第二人民医院，兰州730000。